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單抗制備常見(jiàn)問(wèn)題分析
1.  為什么我的細(xì)胞生長(zhǎng)很慢？
答：可能的原因：
（1）使用了劣質(zhì)的培養(yǎng)耗材、培養(yǎng)基、血清、HAT或HT。建議新手使用廠商的試劑或耗材。對(duì)于血清，可能需要從多個(gè)廠家選用多個(gè)批次試用，選擇出比較好的批次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在試用血清的時(shí)候，一般可以使用相對(duì)較低濃度的血清進(jìn)行骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)骨髓瘤細(xì)胞的倍增速度確實(shí)血清質(zhì)量。
（2）使用的血清或培養(yǎng)基濃度不正確。仔細(xì)檢查配方是否正確。
（3）制備飼養(yǎng)層的方法不正確。參見(jiàn)本頁(yè)面第二個(gè)問(wèn)題。
（4）其它問(wèn)題，可以參考本頁(yè)面第二個(gè)問(wèn)題。
2.  為什么融合后細(xì)胞不長(zhǎng)或者融合后克隆很少？
答：可以從這幾個(gè)方面考慮：
（1）免疫用的動(dòng)物品系不正確或者品系不純。免疫用的動(dòng)物一般應(yīng)該與骨髓瘤來(lái)源的動(dòng)物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤細(xì)胞時(shí)應(yīng)該選用Balb/C小鼠，同時(shí)必須使用品系純正的小鼠。
（2）培養(yǎng)基中加入了過(guò)高濃度的HAT，或者僅A的濃度過(guò)高或HT的濃度過(guò)低，建議用純的骨髓瘤和已有的雜交瘤作HAT濃度篩選。
（3）培養(yǎng)基不正確或血清濃度不正確或使用了劣質(zhì)血清。
（4）未正確制備飼養(yǎng)層細(xì)胞。參見(jiàn)本站有關(guān)飼養(yǎng)層細(xì)胞制備的部份。
（5）接種雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)板過(guò)多。一般在5-20塊96孔板為宜。
（6）融合后，未及時(shí)轉(zhuǎn)移或稀釋細(xì)胞。有人在做融合后喜歡把融合的細(xì)胞先放在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，然后再滴到96孔板上。如果在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也可能出現(xiàn)克隆利率少的情況。
（7）細(xì)胞被污染。在顯微鏡下仔細(xì)觀察是否有明顯的微生物污染。即使看不到有明顯的微生物，也應(yīng)該考慮是否有支原體污染，有條件的可以做支原體檢測(cè)。
（8）細(xì)胞培養(yǎng)條件不正確，確保細(xì)胞培養(yǎng)在恒定的37度較濕的環(huán)境，同時(shí)保證CO2濃度在4-5%左右。
（9）其它與融合條件相關(guān)的不恰當(dāng)?shù)囊蛩?。詳?jiàn)本站有關(guān)細(xì)胞融合的部份。
3.  為什么我凍存的細(xì)胞很難復(fù)蘇或者復(fù)蘇不活？
答：這個(gè)問(wèn)題要從兩個(gè)方面來(lái)回答，一是凍存方面，二是復(fù)蘇問(wèn)題。 對(duì)于凍存過(guò)程，需要注意：
（1）凍存液的配方。這個(gè)問(wèn)題很關(guān)鍵，一個(gè)良好的凍存液配方可以使細(xì)胞保存得非常好，而一個(gè)不好的凍存液配方可能會(huì)讓細(xì)胞傾刻死亡。目前認(rèn)為比較好的配方有：10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%養(yǎng)過(guò)雜交瘤的培養(yǎng)基，不管是哪一種，凍存保護(hù)劑DMSO的含量非常重要，如果這個(gè)濃度過(guò)低，則起不到保護(hù)作用，凍存的細(xì)胞終會(huì)死于冰晶形成時(shí)的張力，如果濃度過(guò)高，則細(xì)胞中毒而亡。如果使用第二個(gè)配方，注意一定要用養(yǎng)過(guò)雜交瘤的培養(yǎng)基，而盡量不要用一般的*培養(yǎng)基，而且一定是配養(yǎng)需要凍存的那一株的培養(yǎng)基。文獻(xiàn)中也有提到用甘油作為凍存保護(hù)劑的，站長(zhǎng)自己沒(méi)有親自試過(guò)，不發(fā)表評(píng)論。如果新手確實(shí)對(duì)這個(gè)沒(méi)把握，上也有商品化的凍存液，買(mǎi)回來(lái)按照說(shuō)明書(shū)操作就OK了。
（2）凍存過(guò)程中，不可用力過(guò)大，在凍存液中重懸細(xì)胞的時(shí)候更是要輕柔，因?yàn)樵贒MSO存在的條件下，細(xì)胞膜變得非常脆弱，如果用力過(guò)猛，則細(xì)胞膜很容易破，復(fù)蘇成活的機(jī)會(huì)就明顯會(huì)下降。
（3）凍存的程序也非常重要。實(shí)踐表明，以每分鐘1 ℃的速度下降凍存細(xì)胞是的。如果條件簡(jiǎn)易，可以把細(xì)胞放在4 ℃半小時(shí)左右，然后再在-20 ℃放置1-2小時(shí)，后轉(zhuǎn)入-80 ℃放置一晚上，終轉(zhuǎn)入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80 ℃也行。現(xiàn)在上有比較貴的凍存盒，把需要存放的細(xì)胞放進(jìn)去，然后直接放-80 ℃就行，等時(shí)間夠長(zhǎng)后直接轉(zhuǎn)至液氮中即可。
（4）細(xì)胞需要保存在液氮的氣相中，而不是泡在液相里。否則液氮很容易進(jìn)入凍存管。這一點(diǎn)很多人都沒(méi)有注意，大部份人都是直接往液相里放，其實(shí)這是錯(cuò)誤的。有人認(rèn)為，普通的液氮中可能含有微生物或者孢子什么的，如果放在液相中，這些微生物或孢子就有機(jī)會(huì)進(jìn)入凍存管，終可能造成細(xì)胞污染。
（5）保證被凍存的細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，并且沒(méi)有被污染。
4.  為什么免疫后沒(méi)有效價(jià)或免疫后效價(jià)低？

單抗制備常見(jiàn)問(wèn)題分析