2018年9月，使用MALDI-TOF，通過(guò)檢測(cè)動(dòng)物種類特異性多肽的動(dòng)物毛發(fā)鑒定法作為標(biāo)準(zhǔn)（ISO）在日本發(fā)行。另外，它還將被確定為日本工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（JIS）。即使僅用1根毛發(fā)，也可采用該鑒別法進(jìn)行分析。因此不僅可以防止山羊絨的假冒，還可以用于進(jìn)行羽毛、人的頭發(fā)等各種毛發(fā)的鑒別以及食品混入異物檢查。該方法由金澤工業(yè)大學(xué)基因組生物工學(xué)研究所基于島津MALDI-TOF系統(tǒng)開(kāi)發(fā)。

動(dòng)物毛發(fā)鑒別分析技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域都起著重要作用。動(dòng)物毛發(fā)被用于制作外套、上衣、毛衣等各種纖維制品。制作這樣的纖維制品時(shí)，有義務(wù)根據(jù)家庭用品品質(zhì)標(biāo)識(shí)法對(duì)纖維的種類、使用多種纖維時(shí)的混用率進(jìn)行標(biāo)識(shí)。另外，毛發(fā)混入食品中時(shí)，確定毛發(fā)種類對(duì)明確混入途徑至關(guān)重要。

除去水分，90%左右的毛發(fā)由蛋白質(zhì)組成。圖1顯示的是動(dòng)物毛發(fā)的構(gòu)造。

圖 1 動(dòng)物毛發(fā)的模式圖

毛發(fā)在防止外部沖擊的同時(shí)，還起到了保溫的作用，這一功能和毛發(fā)的構(gòu)造有著密切的關(guān)系。毛發(fā)的蛋白質(zhì)中含有大量的類固醇，通過(guò)類固醇結(jié)合，在分子間形成了多個(gè)交聯(lián)結(jié)構(gòu)。毛發(fā)的化學(xué)分析需要進(jìn)行溶解，使用名為還原劑的物質(zhì)來(lái)切斷二硫鍵。另外，所得到的蛋白質(zhì)提取液中含有多種蛋白質(zhì)和鹽類等物質(zhì)，因此，需要通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）等進(jìn)行純化。動(dòng)物毛發(fā)纖維MALDI-TOF鑒定流程如圖2所示：

圖2  MALDI-TOF MS 的獸毛分析法

經(jīng)過(guò)胰蛋白酶處理的多肽MALDI-TOF MS分析，用MALDI-TOF MS檢測(cè)金屬靶板上的結(jié)晶樣品。調(diào)整激光功率等的檢測(cè)條件，確保在觀察動(dòng)物種類特異性峰值的m/z2450-2750領(lǐng)域能得到良好的分辨率。

通過(guò)對(duì)SDS-PAGE蛋白條帶進(jìn)行胰蛋白酶解后的樣品，進(jìn)行MALDI-TOF MS檢測(cè)。找到不同動(dòng)物種類的特異性峰值代表。

(a) Band1 KeratinⅡ (b) Band2 KeratinⅠ

圖 3  MALDI-TOF MS 檢測(cè)圖譜

通過(guò)MALDI-TOF MS技術(shù)找到山羊絨、羊毛、牦牛毛三者之間的差異峰值區(qū)間m/z 2450-2750和特異峰值。如圖4所示。

圖 4  MALDI-TOF MS 中的動(dòng)物物種類特異性峰值

表1 動(dòng)物種類特異肽的氨基酸序列＊1

*1 涂黑的峰值為主峰

對(duì)這些動(dòng)物種類特異性峰值進(jìn)行MS/MS分析，推測(cè)氨基酸排列的結(jié)果如表1所示2）。由23個(gè)氨基酸組成的肽，山羊絨和羊毛之間有1個(gè)，山羊絨和牦牛毛之間有4個(gè)氨基酸不同。

很多纖維制品在加工工序中會(huì)進(jìn)行漂白、脫色、染色等化學(xué)處理，但動(dòng)物毛發(fā)特殊的峰值位置不會(huì)因?yàn)檫@些處理而改變，因此明確其可用于識(shí)別纖維制品中的動(dòng)物毛發(fā)種類。

1根毛發(fā)的分析

分析纖維制品中的動(dòng)物毛發(fā)時(shí)，為了避免產(chǎn)品成分出現(xiàn)偏差，好對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行大范圍采樣并進(jìn)行平均化，然后使用其中的一部分。因此，很少需要微量分析。另一方面，在分析食品中混入的毛發(fā)時(shí)，建議盡可能采用少量試樣進(jìn)行分析。

在科學(xué)調(diào)查中，通過(guò)毛發(fā)的DNA分析可以得到很多與血型等能夠確定個(gè)人特征相關(guān)的信息。但是，纖維制品中所使用的動(dòng)物毛發(fā)大多只有毛干部分，特別是被濃重染色的產(chǎn)品，很難進(jìn)行DNA分析。采用MALDI-TOF MS法分析蛋白質(zhì)，即使是1根毛發(fā)也可以充分進(jìn)行檢測(cè)。

根據(jù)動(dòng)物種類的不同，特異性的峰值位置也各不相同，但是同一屬性的動(dòng)物在同一個(gè)位置出現(xiàn)峰值的情況比較多。山羊絨和安哥拉山羊毛等需要用顯微鏡識(shí)別。表2表示主要?jiǎng)游锾禺愋苑逯档姆逯滴恢茫╩/z）以及從數(shù)據(jù)庫(kù)推定的氨基酸排列。貍貓、狐貍、狗的主峰位置是一樣的，但可以看到狐貍的第二峰值是2638，狗是2641，由此能夠?qū)λ鼈冏龀雠袛?。除了此處所示的?dòng)物以外，能夠利用基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的動(dòng)物也可推測(cè)并確認(rèn)特異性峰值的位置。這樣，只看m/z2450-2750的光譜就可確定所含動(dòng)物毛發(fā)的種類，這就是MALDI-TOF MS法的一大特征。

圖 6  1根毛發(fā)MALDI-TOF MS 分析所得到的動(dòng)物種類特異的峰值

表 2 各種動(dòng)物毛發(fā)特異的肽的氨基酸排列和峰值位置（m/z ）

*1 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）推定

參考資料：

島津應(yīng)用新聞No。65及文獻(xiàn)

1)大箸信一、出村由香、佐野元昭、SEN’I GAKKAISHI、68（10）、276 （2012）．

2)大箸信一、出村由香、佐野元昭、吉岡陽(yáng)一郎、SEN’I GAKKAISHI，70 (6)、114 (2014)．

3)ISO20418-2 Textiles ? Qualitative and quantitative proteomic analysis of some animal hair fibres ? Part 2: Peptide  detection using MALDI-TOF MS．