由Equine Racing Co.，Ltd.的*執(zhí)行官Masaru Sese先生提供

1.簡介

在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，除尿液作為藥物測試樣品外，毛發(fā)樣品也在不斷引起研究者注意。由于通常藥物作為尿代謝產(chǎn)物接收檢測時，如果沒能在藥物清除前采集到尿液樣品，就無法檢測出來。而毛發(fā)中的藥物則不會代謝掉，并且停留時間很長。換言之，尿液中的藥物可能會在后一次攝入后幾天內(nèi)，由于代謝和排泄的關(guān)系排除體外，而毛發(fā)樣品的特點在于只要不修剪，即可長期保留攝入歷史。

目前，已將氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）和液相色譜質(zhì)譜（LC-MS）等常規(guī)手段作為檢測毛發(fā)樣品的新方法，投入實際使用。采集的毛發(fā)經(jīng)洗滌、干燥后，切割為約5mm至1cm長度，經(jīng)提取、純化后，進(jìn)行分析。人類毛發(fā)平均每月增長1cm，如果可以確定所測毛發(fā)的位置，即可確定“何時使用過藥物”、“使用過何種藥物”以及“用量多少”。請關(guān)注Ono、Mizuno 等人的文獻(xiàn)，該文獻(xiàn)作為法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的毛發(fā)分析提供參考，包括上述樣品預(yù)處理方法(1) - (3)。

當(dāng)前此類毛發(fā)分析方法不僅在人來源樣品，同時在賽馬藥物檢測領(lǐng)域引起了關(guān)注(4)(5)。迄今報告用于馬毛分析的測試樣品均來自馬鬃毛（以下簡稱“馬毛”）。但是，馬毛通常較長，需要充分洗滌和干燥來去除樣品表面的污染物。另外，由于切割后所得樣品數(shù)量很多，前處理過程也會十分麻煩。

鑒于此，目前除GC-MS或LC-MS方法以外，已有報道使用質(zhì)譜成像（MSI）技術(shù)進(jìn)行毛發(fā)分析的新方法。利用MSI，經(jīng)預(yù)處理的毛發(fā)樣品可被直接分析。近年來，Kamata等發(fā)表使用MSI檢測人類毛發(fā)中藥物攝入史的開創(chuàng)性論文(6) (7)。使用MSI檢測毛發(fā)中的藥物攝入史，則必須沿縱向去除毛發(fā)角質(zhì)層，露出髓質(zhì)。該過程十分困難，因此如參考文獻(xiàn)6所述，盡管制造用裝置進(jìn)行該步驟，依然無法去除長度超過約1-2cm的角質(zhì)層。與人的毛發(fā)不同，馬的鬃毛很長，從而導(dǎo)致這一過程變得更加麻煩，因此目前尚未有在馬毛中進(jìn)行檢測藥物攝入的報道。本文將介紹使用MSI技術(shù)檢測馬毛中甾體抗炎藥磷酸地塞米松的應(yīng)用實例，該馬毛樣品長4cm，經(jīng)手動方式去除角質(zhì)層。

2.質(zhì)譜成像

在質(zhì)譜分析時，分子被離子化，根據(jù)其在電場和磁場中的位移差來測量其質(zhì)量（實際為m/z值，將質(zhì)量除以離子所帶電荷數(shù)）。如前所述，MSI與使用現(xiàn)有GC-MS和LC-MS方法的不同之處在于，無需進(jìn)行提取，可直接分析樣品表面，獲得待測藥物空間分布信息。

通常的實驗步驟包括準(zhǔn)備樣品切片，并將其放置在ITO導(dǎo)電玻璃上。隨后樣品被電離并進(jìn)行質(zhì)譜分析。在分析時，確定樣品檢測區(qū)域和測量點間的間隔，獲取每個測量點的質(zhì)譜圖及對應(yīng)位置信息。獲取所有測量點質(zhì)譜圖后，選擇與目標(biāo)分子對應(yīng)的m/z，并根據(jù)其強度分布獲得目標(biāo)分子的定位信息。與常規(guī)成像技術(shù)不同，IMS不需要進(jìn)行免疫化學(xué)染色或GFP標(biāo)記等。由于直接獲得分子量信息，可區(qū)分目標(biāo)化合物的原型及其代謝物；由于能夠同時電離多種化合物并進(jìn)行質(zhì)譜檢測，可在一次分析中獲得多種不同物質(zhì)的定位信息。

3.iMScope TRIO的開發(fā)理念

目前，可以在多種質(zhì)譜儀上進(jìn)行MSI實驗，可選擇的離子源以及質(zhì)譜種類也是各種各樣。自2004年以來，作者與島津株式會社(8)合作開發(fā)iMScope TRIO™成像質(zhì)譜顯微鏡，目前正在大阪大學(xué)島津分析創(chuàng)新研究實驗室(9)進(jìn)行各種相關(guān)應(yīng)用研究。

iMScope TRIO的開發(fā)理念如圖1所示。盡管普通顯微鏡可以觀察組織結(jié)構(gòu)，但很難獲取相關(guān)各種組分的信息。另一方面，iMScope TRIO將對樣品的顯微觀察和基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）技術(shù)相結(jié)合從而進(jìn)行成像質(zhì)譜分析。

圖1 iMScope TRIO™成像質(zhì)譜顯微鏡的理念

使用常規(guī)顯微鏡，可區(qū)分樣品結(jié)構(gòu)上的差異，但是難以獲取相關(guān)化學(xué)成分的信息。相比之下，iMScope TRIO™可同時進(jìn)行光學(xué)顯微觀察和質(zhì)譜檢測，獲得對應(yīng)組分的強度分析信息。

4.實驗方法

圖2 本研究中使用的分析設(shè)備

（A）iMLayer™：基質(zhì)升華儀，（B）iMScope TRIO ™：成像質(zhì)譜檢測，以及（C）iMScope TRIO ™系統(tǒng)的示意圖。該系統(tǒng)在大氣壓下進(jìn)行樣品的顯微鏡觀察，并使用MALDI電離方式，生成的離子引入離子阱并由飛行時間質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。

本研究使用iMLayer™基質(zhì)升華儀進(jìn)行MALDI基質(zhì)涂敷（圖2（A））。所用基質(zhì)為α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-CHCA，Merck）和9-氨基吖啶（9-AA，東京化學(xué)工業(yè)有限公司），分別用于正離子模式分析和負(fù)離子模式分析，通過iMLayer在樣品表面上涂敷厚度為0.5 μm的基質(zhì)。正離子模式分析中，基質(zhì)升華后，使用噴槍手動噴涂α-CHCA溶液（10   mg/ml，使用30％乙腈/0.1%甲酸溶液）(10)。負(fù)離子模式分析中，9-AA升華后，將5％的甲醇蒸氣噴覆于樣品表面3秒鐘，進(jìn)行重結(jié)晶(11)。

使用iMScope TRIO進(jìn)行檢測（圖2（B），（C））。如上所述，iMScope TRIO配有光學(xué)顯微鏡，可在大氣壓下獲得樣品表面圖像，同時配置大氣壓MALDI離子源。MALDI所用激光器為Nd:YAG激光器，頻率為1 kHz。在大氣壓下產(chǎn)生的離子通過差級真空系統(tǒng)導(dǎo)入質(zhì)量分析單元，并由離子阱飛行時間質(zhì)譜儀檢測。質(zhì)量范圍（m/z）在   50-3000之間，本次目標(biāo)藥物磷酸地塞米松為小分子藥物，質(zhì)量范圍設(shè)定至m/z 1000。

圖3（A）分析流程和（B）馬毛表皮去除方法

在立體顯微鏡下使用冷凍切片機刀片去除角質(zhì)層，暴露出髓質(zhì)

圖3（A）顯示該樣品的的分析流程。基本過程：采集馬毛、去除角質(zhì)層、涂覆基質(zhì)、使用iMScope TRIO檢測成像。用浸有蒸餾水的布擦拭所采集每一束馬毛的表面。該方式僅針對MSI可行，因為MSI無需提取即可直觀分析樣品。相反，在已有方法中，如清洗不充分，在提取過程中會發(fā)生污染問題。清潔馬毛表面后，立即干燥馬毛。將干燥后的馬毛固定于黏貼導(dǎo)電雙面膠帶的ITO載玻片（Matsunami Glass Ind.，Ltd.）上，并使用切片刀在立體顯微鏡下從毛囊末端開始去除角質(zhì)層，如圖3（B）所示。由于馬毛的直徑約為人類毛發(fā)直徑的兩倍（約200μm），因此即使通過手動操作，也可輕松去除表面。除去角質(zhì)層后，將剩余附著于ITO玻璃載玻片上的毛發(fā)作為待測樣品，涂覆基質(zhì)并進(jìn)行檢測。

本研究所使用藥物為地塞米松磷酸鈉（DexaSP），為一類甾體類抗炎藥。DexaSP可使用9-AA基質(zhì)直接以負(fù)離子模式進(jìn)行檢測。或者，通過用吉拉德T試劑（GirT）對DexaSP進(jìn)行衍生化，提高正離子模式的離子化效率（圖4）⁽¹²⁾。

圖4 地塞米松磷酸鈉（DexaSP）是靶向藥物

如進(jìn)行正離子模式檢測，將以Gir T試劑作為衍生試劑生成的DexaSP衍生物作為檢測目標(biāo)。

對于負(fù)離子模式檢測，將無變化的DexaSP作為檢測目標(biāo)。

5.結(jié)果

圖5顯示使用標(biāo)準(zhǔn)品在正離子模式和負(fù)離子模式獲得的檢測結(jié)果。

圖5標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果

正離子模式和負(fù)離子模式均可獲得信號，但考慮前處理的簡便性和離子強度的差異，選擇負(fù)離子模式進(jìn)行檢測。

如前所述，在正離子模式檢測中，將GirT衍生后的DexaSP衍生物作為檢測目標(biāo)，而在負(fù)離子模式檢測中，將無變化DexaSP作為檢測目標(biāo)。正離子模式下， 使用α-CHCA   檢測，DexaSP衍生物的質(zhì)荷比為m/z   586.267，對應(yīng)[GirT-DexaSP-2Na + 2H] +離子。另一方面，負(fù)離子模式中，使用9-AA檢測， [DexaSP-H]- 的質(zhì)荷比為m/z 471.160。

兩種模式下均觀察到DexaSP由來的峰，但鑒于前處理所需時間且負(fù)離子模式強度約高出正離子模式100倍，決定使用9-AA在負(fù)離子模式下對馬毛進(jìn)行檢測。

分析可疑馬毛樣本時，需進(jìn)行對照實驗，檢測未給予DexaSP的馬毛樣品，確認(rèn)沒有m/z 471.160離子的出現(xiàn)（圖6（A））。圖6（B）顯示地塞米松磷酸酯給藥后馬毛的質(zhì)譜成像結(jié)果。

圖6馬毛中DexaSP分布檢測結(jié)果

（A）是未給藥馬匹的馬毛檢測結(jié)果，作為陰性對照；（B）給藥后馬匹的馬毛中檢測結(jié)果（注射15-20 mL由Fujita Pharmaceutical Co.提供的0.1％地塞米松磷酸鈉水溶液，濃度1.315 mg/mL， 連續(xù)注射3天）。用iMScope TRIO™掃描從毛囊開始4 cm長度的馬毛樣本，記錄每1 cm馬毛的檢測結(jié)果，在距毛囊16.48 mm處觀察到較強的目標(biāo)藥物信號。由于馬毛平均每月以2.0 cm的速度生長，可判斷在采樣日期前25天給藥。

測試樣品為2017年7月13日采集的馬毛，該馬匹在2017年6月上旬，連續(xù)3天注射15至20 mL 0.1％的地塞米松磷酸鈉水溶液（Fujita Pharmaceutical Co）。iMScope TRIO的測量間隔在x方向上為80 μm，在y方向上為5 μm，激光斑點大小為2（系統(tǒng)參數(shù)）。

在該實驗中，測量總長為4cm的馬毛，將其劃分為1cm的區(qū)間分別進(jìn)行檢測。在圖6（B）中，所得數(shù)據(jù)雖然分為4個部分，但馬毛樣本并未被分割：4cm長的馬毛被固定在ITO載玻片上。

從毛囊向*進(jìn)行掃描，并在距毛囊約16.48 mm處，檢測到較高強度地塞米松磷酸酯信號。該結(jié)果是*從毛發(fā)中直接檢測到原本會于體內(nèi)迅速代謝的磷酸酯，具有重要意義。此處質(zhì)譜成像結(jié)果使用強度來表示峰強度，并在300-1500強度范圍內(nèi)以多色帶顯示。在這一結(jié)果中暖色表示較高的峰強度。

6.討論

本實驗中，根據(jù)目標(biāo)化合物離子化效果選擇負(fù)離子模式進(jìn)行分析，成功在馬毛中檢測出目標(biāo)藥物。給藥后的馬毛樣本中，在距毛囊16.48 mm位置處觀察到較強的藥物信號。馬毛的平均生長速度為每月2cm，是人類的兩倍?；谠撋L速率以及大強度信號距離毛囊的位置估算給藥時間，大約在24-25天前。根據(jù)給藥記錄，該藥物在采集毛發(fā)前約一個月給藥，通過對比該信息，認(rèn)為藥物定位正確。

另一方面，盡管離子強度較低，但是在毛囊附近依然檢測到一些信號。經(jīng)確認(rèn)質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)該信號源自噪聲，由此認(rèn)為進(jìn)一步提高離子化效率和信噪比對分析實際樣品十分重要。為達(dá)到這一目標(biāo)，可能需要進(jìn)一步改進(jìn)基質(zhì)涂覆方法或選擇其他基質(zhì)。

7.總結(jié)與展望

地塞米松磷酸鈉是一種經(jīng)獲準(zhǔn)使用的抗炎藥，但禁止在比賽前使用(13)。近一次在2016年12月東京大獎賽上，賽馬阿波羅肯塔基在賽后發(fā)現(xiàn)使用過這一藥物的事件依然記憶猶新。本次結(jié)果是將iMLayer基質(zhì)升華與iMScope TRIO成像質(zhì)譜分析相結(jié)合，應(yīng)用于違禁藥物檢測領(lǐng)域的示例。

此外，由于磷酸酯可在體內(nèi)迅速代謝，直接在毛發(fā)中檢測到未變化藥物同樣是一項十分重要的成果。另一方面，由于在成像結(jié)果中存在大量噪聲，有必要對毛發(fā)預(yù)處理流程進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，提高離子強度。從該檢測結(jié)果來看，探索對可檢測藥物（包括合成類固醇類）定量分析方法的建立也是*的。盡管該應(yīng)用仍存在許多問題以待解決，但我們依然認(rèn)為iMScope TRIO的潛力十分值得期待。

8.馬毛分析的可能性

當(dāng)前，世界范圍內(nèi)關(guān)于賽馬違禁藥物控制的討論很多，討論賽馬違禁藥物檢測和賽馬傷害保護(hù)（ICRAV：賽馬分析專家和獸醫(yī)會議）的會議每兩年召開一次。2018年，在阿拉伯聯(lián)合酋長國的迪拜舉行該會議，作者*參加并介紹了這項研究結(jié)果。圖7顯示了會場和Meydan賽馬場的景色。能夠在世界賽馬場之一的Meydan賽馬場旁會議廳中展示這項研究，是迄今為止作者一生中難忘的事件之一。

通常，來自日本的參會者均為JRA相關(guān)人員或賽馬化學(xué)實驗室的研究人員，而作者則是大學(xué)中的參會者。不僅如此，來自香港賽馬會、澳大利亞賽馬會和其他地方的研究人員對使用IMS進(jìn)行藥物檢測產(chǎn)生了濃厚興趣并寄予厚望，討論非?；钴S。

2018年11月，在撰寫本文時，巖手賽馬比賽中參賽的賽馬Ubatouban被檢測出使用禁用藥品去氫睪酮(14)。今后，作者將繼續(xù)改進(jìn)和優(yōu)化該檢測方法（包括簡化毛發(fā)前處理技術(shù)），使這種來自日本的新型檢測方法在世界賽馬領(lǐng)域中用以進(jìn)行違禁藥品檢測。

作者同時還得到島津制作所的大力支持，并與Equine   Racing Co., Ltd.的全體員工進(jìn)行廣泛合作，其中來自Equine   Racing Co., Ltd.的代表人也是本文的合著者。

作者將在圖8中展示馬毛采樣圖片以及作者和合著者的新照片作為本文的結(jié)尾。

圖7 ICRAV2018

（A）、（B）ICRAV 2018會場的場景，（C）舉行ICRAV的Meydan賽馬場傾城。Meydan賽馬場景色壯觀，其規(guī)模和完備程度在日本也*。

圖8參觀Equine Racing Co., Ltd.

（A）Equine Racing Co., Ltd.的工作人員介紹馬匹。（B）在馬腿上可以看到的稱為“栗子”的部分：角質(zhì)化的退化拇指（C）鬃毛采樣 （D）作者（右）和合著者（左）的近期照片。

參考資料

(1)Masahiro Ohno (2005) Asahi Law Review, 32, 144-199

(2)Dai Mizuno (2017) Analysis, 12, 589-590

(3)Shima N et al. (2017) Drug. Metab. Dispos., 45, 286-293, https://doi.org/10.1124/dmd.116.074211

(4)Wong JKY et al. (2018) J. Pharm. Biomed. Anal., 158,   189-203, https://doi.org/10.1016/j.jpba.2018.05.043

(5)Madry MM et al. (2016) BMC Vet. Res., 12, 84, https://doi.org/10.1186/s12917-016-0709-5

(6)Kamata T et al. (2015) Anal. Chem., 87, 576-81,   https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.5b00971

(7)Hang W, Ying Wang (2017) Anal. Chimica Acta, 975,   42-51, https://doi.org/10.1016Zj.aca.2017.04.012

(8)Harada T et al. (2009)   Anal. Chem., 81,9153-7,   https://doi.org/10.1021/ac901872n

(9)https://www.shimadzu.co.jp/labcamp/

(10)Shimma S et al. (2013) J. Mass Spectrom., 48, 1285-90,   https://doi.org/10.1002/jms.328

(11)Nakamura J et al. (2017) Anal. Bioanal. Chem., 409, 1697-1706, https://10.1007/s00216-016-0118-4

(12)Shimma S et al.(2016) Anal. Bioanal. Chem., 408, 7607-7615,   https://doi.org/10.1007/s00216-016-9594-9

(13)http://company.jra.jp/0000/law/law07/07.pdf

(14) http://www.iwatekeiba.or.jp/news/180915i

本文中描述的產(chǎn)品尚未獲得日本《藥品和醫(yī)療設(shè)備法》批準(zhǔn)，尚不能用作醫(yī)療設(shè)備。該設(shè)備不能用于醫(yī)學(xué)檢查、治療或相關(guān)程序。

iMScope TRIO和iMLayer是島津株式會社在日本和/或其他國家的商標(biāo)。

在本文中，無論是否以商標(biāo)符號“ TM”或“®”出現(xiàn)，第三方商標(biāo)和商品名稱均指實體或其產(chǎn)品/服務(wù)。