?

原子力顯微鏡作為一種三維形貌觀察工具，不僅具備超高分辨率，而且支持在液體環(huán)境下工作，是一種理想的生命科學(xué)/醫(yī)學(xué)觀測(cè)設(shè)備。除了形貌觀察外，原子力顯微鏡還可以對(duì)多種表面屬性進(jìn)行定量觀測(cè)。例如，基于力學(xué)測(cè)試的表面機(jī)械性能測(cè)試。這些性能為原子力顯微鏡應(yīng)用于細(xì)胞和生物分子研究提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

01 iPS干細(xì)胞研究

干細(xì)胞的研究一直受制于供體細(xì)胞很難獲得，而且相關(guān)實(shí)驗(yàn)的倫理風(fēng)險(xiǎn)也不容忽視。因此2007年發(fā)明的誘導(dǎo)式多能干細(xì)胞(iPS)技術(shù)成為理想的胚胎干細(xì)胞替代技術(shù)。iPS細(xì)胞在形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細(xì)胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都與胚胎干細(xì)胞相似。但是iPS轉(zhuǎn)化過(guò)程中，會(huì)有一定的幾率發(fā)展為癌細(xì)胞。不同體細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞成瘤性有差異。因此，如何篩選安全型iPS細(xì)胞是該技術(shù)能夠進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。

可以使用原子力顯微鏡對(duì)未分化的iPS細(xì)胞和HeLa細(xì)胞進(jìn)行觀察比較。HeLa細(xì)胞是一種被廣泛使用的癌變細(xì)胞，因此可以和iPS細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比觀察。

上圖顯示了SPM形狀圖像(a)HeLa細(xì)胞和(b)iPS細(xì)胞。用光學(xué)顯微鏡觀察到的相應(yīng)相位差圖像分別顯示在(c)和(d)中。圖中箭頭所示位置處的截面形狀輪廓如(e)和(f)所示。

從細(xì)胞形態(tài)上來(lái)看，HeLa細(xì)胞呈圓頂形，表面隆起比較高，約7um；而iPS細(xì)胞呈扁平狀且細(xì)胞間粘附呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞高約1.7um。仔細(xì)觀察細(xì)胞之間的邊界，可以看出HeLa細(xì)胞之間的邊界呈凹陷狀，而iPS細(xì)胞之間的邊界是凸起的，而且呈網(wǎng)絡(luò)狀。據(jù)此可分析得知這兩種細(xì)胞各自的細(xì)胞間粘附具有差異，且HeLa細(xì)胞之間的粘附較弱，而iPS細(xì)胞之間的粘附較強(qiáng)。

除了形貌觀察外，原子力顯微鏡還可以通過(guò)力學(xué)測(cè)量獲得細(xì)胞表面的機(jī)械性能。如下圖所示，用探針針尖壓觸細(xì)胞表面，通過(guò)對(duì)探針獲得的力反饋分析樣品各類機(jī)械性能。

使用彈簧常數(shù)為0.15N/m的OMCL-TR800PSA探針，在培養(yǎng)液環(huán)境中對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試。對(duì)細(xì)胞的最終壓力(排斥力)為2.5nN。通過(guò)比較從探針與樣品接觸的位置到達(dá)到2.5nN的力的變化，確定樣品的硬度。

(a)和(b)顯示了SPM觀察到的HeLa和iPS細(xì)胞的細(xì)胞形狀圖像，(c)和(d)顯示了相應(yīng)的ZX斷面圖像，是從樣品豎截面方向看時(shí)在(a)和(b)中箭頭所示的X線位置處施加到探針的力的圖像。圖中上方為測(cè)量起點(diǎn)，下方白色虛線為壓觸終點(diǎn)，顯示了樣品截面形狀輪廓。

在ZX圖像中，探針與樣品接觸后檢測(cè)到力的位置以黃色到紅色的顏色顯示。這表明探針對(duì)細(xì)胞的變形，所以可以理解為較大量的細(xì)胞變形顯示出細(xì)胞的較軟部分?？梢詮募?xì)胞變形量了解硬度。(c)中的HeLa細(xì)胞顯示出均勻的變形，但相比之下，在(d)中的iPS細(xì)胞中，細(xì)胞體較軟，細(xì)胞間粘附區(qū)較硬。

分析結(jié)果表明，HeLa細(xì)胞表面硬度比較均勻，軟硬部分差別不大，而iPS細(xì)胞主體較軟，細(xì)胞間粘附區(qū)較硬。

02 DNA雙螺旋的高分辨觀察

DNA是經(jīng)常會(huì)被觀測(cè)的一種樣品，使用基于調(diào)幅的輕敲/動(dòng)態(tài)模式，一般只能看清鏈狀結(jié)構(gòu)。

液體環(huán)境下輕敲模式掃描DNA鏈

提高液體環(huán)境中的分辨率的辦法就是使用調(diào)頻模式替代調(diào)幅模式（輕敲/動(dòng)態(tài)模式），完美應(yīng)對(duì)了生物樣品的測(cè)試需求。

傳統(tǒng)的調(diào)幅模式檢測(cè)在自由振動(dòng)和受迫振動(dòng)下同一頻率處的振幅變化。這種模式受懸臂梁振動(dòng)質(zhì)量因子（Q值）的影響非常大，在液體環(huán)境中，因?yàn)橐后w對(duì)懸臂梁的粘滯阻力，導(dǎo)致Q值急劇降低，從而使分辨率變差。而調(diào)頻模式是檢測(cè)在自由振動(dòng)和受迫振動(dòng)下維持振幅不變時(shí)頻率的偏移，在此模式下，分辨率受Q值的影響較小，因此在液體中依然可以保持原子/分子級(jí)別的高分辨率。而使用調(diào)頻模式，可以對(duì)緩沖溶液或者培養(yǎng)液環(huán)境下的生物大分子進(jìn)行超高分辨的觀測(cè)，獲得接觸模式或者輕敲模式無(wú)法達(dá)到的超高分辨率。

同樣是觀察DNA雙螺旋鏈，使用調(diào)頻模式，可以清晰地分辨雙螺旋結(jié)構(gòu)，雙螺旋結(jié)構(gòu)形成的大溝小溝結(jié)構(gòu)也非常明顯。

更細(xì)致地觀察一個(gè)螺距，還可以分辨表面的堿基數(shù)目。

對(duì)相鄰兩個(gè)螺旋的剖面圖進(jìn)行分析，觀察到的堿基數(shù)量與理論值完全符合。這說(shuō)明調(diào)頻模式在液體環(huán)境中，對(duì)柔軟的生物樣品觀察，依然可以達(dá)到基團(tuán)級(jí)別的分辨率。

03 外泌體觀察

外泌體和微泡是醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)的前沿研究熱點(diǎn)。然而，對(duì)于它們的三維形態(tài)和膜的物理性質(zhì)還有許多方面的認(rèn)識(shí)尚不清楚。外泌體因?yàn)?/span>其單層膜的性質(zhì)，所以非常軟，對(duì)使用原子力顯微鏡測(cè)試提出了極高的要求。

我們用原子力顯微鏡觀察了鹽溶液中的兩類外泌體并對(duì)其膜進(jìn)行了表征。

以上兩幅圖就是不同尺寸的外泌體，其外徑從20nm到140nm不等，表面極其柔軟，楊氏模量一般只有幾千Pa。

原子力顯微鏡作為一種傳統(tǒng)意義上的材料學(xué)表面分析工具，隨著其技術(shù)的不斷迭代發(fā)展，已經(jīng)深入地滲透到了生命科學(xué)/醫(yī)學(xué)的研究與實(shí)驗(yàn)中。尤其是如生物醫(yī)學(xué)工程、仿生學(xué)等一些交叉學(xué)科，新材料新方法的引入已經(jīng)極大促進(jìn)了這些領(lǐng)域從理論到實(shí)際應(yīng)用的延伸。

本文內(nèi)容非商業(yè)廣告，僅供專業(yè)人士參考。