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根據(jù)下列的免疫細胞化學(xué)故障排除指南來快速找出問題原因，改善您的實驗步驟和解決方案。首先從下列選項中找到對應(yīng)您免疫細胞化學(xué)染色問題的圖片:
| 染色較弱或沒有染色 | 高背景染色 | 非特異性染色 |
 |  |  |
一、染色較弱或沒有染色：
細胞從蓋玻片上脫離: 減少洗滌步驟或輕緩洗滌；用多聚賴氨酸將細胞黏合到蓋玻片上
細胞沒有被通透: 甲醇和丙酮固定能使細胞通透性增強；如果使用甲醛, 用0.2% Triton X-100通透細胞
細胞失水變干: 在整個染色過程中樣品必須保持覆蓋于液體中
細胞固定過度: 減少固定時間
一抗量不夠: 提高抗體濃度；加長孵育時間；
孵育時間太短: 增加一抗和樣品的孵育時間
切片儲存問題: 樣品處理之后應(yīng)該應(yīng)該馬上成像，不然信號會隨時間推移而減弱。如果需要可以將切片于 4?C 黑暗處儲存。
一抗二抗不兼容: 二抗應(yīng)該是抗一抗宿主的。例如，如果一抗是小鼠來源的，那就需要用抗小鼠的二抗；亞型需要兼容
一抗不適用: 確?？贵w驗證過可以用于ICC；先在免疫印跡中測試抗體, 確?？贵w沒有變質(zhì)
儲存問題: 反復(fù)冷凍/解凍是對抗體不利的，可引起降解. 最好是在收到產(chǎn)品時將其分成多個小份來保存；抗體沒有按照建議的方式保存. 如果是這樣的話可能需要重新購買一支；如果二抗沒有在黑暗處保存 (使用免疫熒光時), 應(yīng)更換一支新的二抗。
蛋白沒有在檢測的組織中出現(xiàn): 做一個陽性對照；如果目標蛋白顯現(xiàn)但是信號不強, 增加一個擴大信號步驟
二、高背景染色
抗體濃度太高: 稀釋一抗/二抗
非特異結(jié)合: 做一個沒有一抗的二抗空白對照. 如果有染色，說明二抗有非特異性結(jié)合，更換一種二抗。
阻斷不夠: 增加阻斷孵育時間或考慮更換阻斷劑。
信號放大過度: 減少信號放大孵育時間，稀釋二抗
洗滌不充分: 步驟之間的適當洗滌非常重要. 確保遵循說明說上的洗滌步驟。
三、非特異性染色
抗體濃度過高: 降低抗體的濃度和孵育時間
一抗產(chǎn)自和待測樣本來源同樣的物種 (例. 小鼠抗小鼠): 盡量使用來自不同物種的一抗. 或者阻斷內(nèi)源IgG. 還可以嘗試在孵育時使用1% Triton 來清洗組織. 或用TBS-Tween 20替換 PBS-Tween 20作為洗滌液。
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