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JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒

產(chǎn)品描述
　　線粒體膜電位降低是細(xì)胞早期凋亡的一個標(biāo)志，它發(fā)生在細(xì)胞膜上的磷酯酰絲氨酸外翻與caspase水解酶激活之前。當(dāng)線粒體膜通透性發(fā)生改變時，膜電位會降低。這種膜電位的改變是由于 Bax二聚體的形成和 Bid, Bak, Bad的激活，從而誘導(dǎo)線粒體膜形成孔隙造成的。當(dāng)這些促凋亡蛋白被激活時，線粒體同時也將細(xì)胞色素 C 釋放到細(xì)胞質(zhì)中。
　　JC-1 是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△ Ψm的理想熒光探針，它可以檢測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，JC-1 聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時 JC-1 為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。通過 JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到膜電位的下降，同時也可以用 JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個檢測指標(biāo)。
　　JC-1單體的大激發(fā)波長為 510 nm，大發(fā)射波長為527 nm；JC-1 聚合物的大激發(fā)波長為 585 nm，大發(fā)射波長為 590 nm。JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒操作簡單快速，可以通過流式細(xì)胞儀，熒光顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀檢測。
訂購信息

產(chǎn)品組分

保存方法
　　組分A、B需4℃避光冷藏，并盡量避免反復(fù)凍融，組分C﹣20℃保存。有效期見外包裝。
光譜特性
Ex/Em：
510/527 nm（單體物，綠色）；
585/590 nm（聚合物，紅色）。
操作步驟
1.試劑準(zhǔn)備：
配制 JC-1 工作液
按如下方案配置1mL 1×JC-1染色工作液：取10 µL 100×JC-1染色液，加入到890 µL滅菌的diH2O中，渦旋混勻，向上述混合液中加入100 µL 10× Assay Buffer，渦旋混勻，即可得到1×JC-1染色液。
【注】：
（1）配置體積可同比例擴(kuò)大或縮小。
（2）不建議直接用1×Assay Buffer稀釋100×JC-1染色液，可能會出現(xiàn)沉淀。
配制1× Assay Buffer
用 diH2O 按 10：1 稀釋檢測緩沖液（如1 mL 10×assay buffer + 9 mL diH2O）。
2.流式細(xì)胞染色方案：
細(xì)胞染色
開始實(shí)驗(yàn)之前，請確保JC-1和CCCP溶液已恢復(fù)至室溫。
（1）按實(shí)驗(yàn)所需，在培養(yǎng)板中接種細(xì)胞（懸浮細(xì)胞不要超過106個/mL）。
（2）陽性對照組：根據(jù)培養(yǎng)基的量加入相應(yīng)體積50 mM的CCCP溶液（如終濃度為50 μM即1 mL培養(yǎng)基加入1 μL 50 mM的CCCP溶液），37℃孵育20 min。對于特定的細(xì)胞，CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料確定。
（3）對于貼壁細(xì)胞，染色前先進(jìn)行消化處理，將其制成細(xì)胞懸液，0.5 mL裝于離心管中。
（4）室溫下400 x g，離心5 min。
（5）除去上清。
（6）用0.5 mL的 JC-1 工作液重懸細(xì)胞。
（7）置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，孵育 15 min。
（8）室溫下400 x g，離心 5 min，去除上清。
（9）用 2 mL 的 PBS 緩沖液、培養(yǎng)基或1× Assay Buffer重懸細(xì)胞，離心去除上清，重復(fù)一次。
（10）用 0.5 mL的 PBS 、培養(yǎng)基或1× Assay Buffer重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測分析。
流式細(xì)胞儀定量分析
對于正常細(xì)胞，在PE或PI（FL2）通道可以檢測到線粒體內(nèi)的JC-1紅色聚集物；對于凋亡細(xì)胞，在FITC（FL1）通道可以檢測到JC-1綠色單體物。
3.熒光顯微鏡染色方案：
懸浮細(xì)胞染色
（1）參照流式細(xì)胞儀染色方案，對細(xì)胞進(jìn)行染色。
（2）用0.3 mL的 PBS或培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。
貼壁細(xì)胞染色
（1）在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板上接種細(xì)胞。
（2）陽性對照組：根據(jù)培養(yǎng)基的量加入相應(yīng)體積50 mM的CCCP溶液（如終濃度為50 μM即1 mL培養(yǎng)基加入1 μL 50 mM的CCCP溶液），37℃孵育20 min。對于特定的細(xì)胞，CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料確定。
（3）去除培養(yǎng)基，加入JC-1工作液使其覆蓋細(xì)胞表面。
（4）置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，孵育 15 min。  
（5）除去染液，用PBS 緩沖液、培養(yǎng)基或1× Assay Buffer清洗一次細(xì)胞。
（6）用熒光顯微鏡觀察分析。
熒光顯微鏡成像
采用可以同時檢測熒光素和羅丹明，或者熒光素與Texas Red 的雙通道濾波器熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。對于正常細(xì)胞，擁有完整的線粒體膜電位，線粒體在590 nm處發(fā)出紅色熒光，細(xì)胞質(zhì)發(fā)出綠色熒光；對于凋亡或壞死的細(xì)胞，染料以單體形式存在，在530 nm處發(fā)出綠色熒光。
4.測定熒光相對比率染色方案：
（1）按照實(shí)驗(yàn)要求在96孔板中接種細(xì)胞。
（2）陽性對照組：根據(jù)培養(yǎng)基的量加入相應(yīng)體積50 mM的CCCP溶液（如終濃度為50 μM即1 mL培養(yǎng)基加入1 μL 50 mM的CCCP溶液），37℃孵育20 min。對于特定的細(xì)胞，CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料確定。
（3）根據(jù)熒光顯微鏡細(xì)胞染色方案對細(xì)胞進(jìn)行染色處理。
（4）用熒光酶標(biāo)儀檢測熒光值（紅色熒光：Ex/Em=550/600 nm；綠色熒光 Ex/Em=485/535 nm）。
（5）計算紅綠熒光比值。
（6）與正常細(xì)胞相比，在凋亡或壞死細(xì)胞中，紅綠熒光比值會降低。
注意事項(xiàng)
　　該產(chǎn)品*于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。