EdU細(xì)胞增殖流式檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品描述
細(xì)胞增殖是評(píng)價(jià)細(xì)胞活性、代謝、生理和病理狀況的重要指標(biāo)。EdU (5-Ethynyl-2`- deoxyuridine)是一種胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物，其連有的炔烴基團(tuán)在天然化合物中很少見(jiàn)，能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶(T)摻入正在復(fù)制的DNA分子中，通過(guò)基于EdU與熒光染料的特異性共軛反應(yīng)，把熒光集團(tuán)標(biāo)記到新合成的含有EdU的DNA上面，這樣可以進(jìn)行高效快速的檢測(cè)出DNA復(fù)制活性，此技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、生長(zhǎng)與發(fā)育、DNA損傷修復(fù)等方面的研究。
傳統(tǒng)的免疫熒光染色(BrdU)檢測(cè)方法需要DNA變性、抗原修復(fù)、抗原抗體過(guò)夜孵育等復(fù)雜繁瑣的操作步驟。而EdU檢測(cè)方法不需要?jiǎng)×业腄NA變性，只需溫和的細(xì)胞固定化和透化處理，能夠較好地保護(hù)細(xì)胞形態(tài)、DNA整體結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)抗原識(shí)別位點(diǎn)，操作步驟更加快速、靈敏和準(zhǔn)確。EdU與胸腺嘧啶(T)結(jié)構(gòu)非常相似，大小卻只有BrdU抗體的1/500，很容易在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散；無(wú)需抗原抗體反應(yīng)，能在細(xì)胞和組織水平更快速便捷地反映DNA復(fù)制活性。
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產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存
常溫運(yùn)輸。4℃保存，有效期12個(gè)月。
使用方法
細(xì)胞培養(yǎng)
將細(xì)胞接種于孔板中（以下溶液加入量是以6孔板為例），培養(yǎng)至正常生長(zhǎng)階段。
藥物處理
根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行各種細(xì)胞處理。
EdU標(biāo)記
1.設(shè)置1個(gè)不加EdU標(biāo)記培養(yǎng)基的NC對(duì)照組，以便進(jìn)行流式檢測(cè)數(shù)據(jù)的背景分析。
2.將細(xì)胞培養(yǎng)基與EdU溶液按照500：1的比例混合，制成2×EdU標(biāo)記培養(yǎng)基。
3.提前將2×EdU標(biāo)記培養(yǎng)基預(yù)熱，然后將500微升2×EdU標(biāo)記培養(yǎng)基與等體積細(xì)胞培養(yǎng)基混合，獲得6孔板中每孔1ml 1×EdU溶液。
【注】：①不建議替換全部培養(yǎng)基，這樣可能會(huì)影響細(xì)胞增殖的速度；②配置好的培養(yǎng)基建議現(xiàn)用現(xiàn)配，用量以沒(méi)過(guò)細(xì)胞為宜。
4.孵育細(xì)胞2 h，棄培養(yǎng)基。
【注】：①培養(yǎng)時(shí)間取決于細(xì)胞的增殖速度和生長(zhǎng)狀態(tài)；②大多數(shù)腫瘤細(xì)胞以及粘附細(xì)胞系均可采用2 h的孵育時(shí)間。
5.將細(xì)胞收集至流式管中，1000rpm 離心5 min，用槍頭吸棄上清。
【注】：①如貼壁細(xì)胞，請(qǐng)先消化收集；②離心轉(zhuǎn)速可按特定細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)置。
6.以1×PBS清洗細(xì)胞，1000rpm 離心5 min，用槍頭吸棄上清。
細(xì)胞的固定和通透
1.每管加入1mL 4%多聚甲醛細(xì)胞固定液固定15-30 min，1000rpm 離心5 min，棄固定液。
2.每管加入2mL 2mg/mL 甘氨酸，搖床孵育5 min，以中和過(guò)量的多聚甲醛。
3.1000rpm 離心5 min，棄甘氨酸溶液，每管加入2mL PBS洗液清洗，1000rpm 離心5 min，棄上清。
4.每管加入1mL 0.5% Triton X-100細(xì)胞通透液，室溫通透10 min，1000rpm 離心5 min，棄細(xì)胞通透溶液。
5.每管加入2mL PBS洗液，室溫清洗5 min，1000rpm 離心5 min，吸棄上清。
EDU染色
1.通過(guò)用10：1去離子水稀釋反應(yīng)緩沖液，進(jìn)行配制1×反應(yīng)緩沖液。
2.按照溶解 200 mg緩沖添加劑溶于1 mL去離子水的比例稱(chēng)取適量的粉末進(jìn)行溶解，即為可用的緩沖添加劑的濃度，建議現(xiàn)用現(xiàn)配。
【注】：緩沖添加劑為白色粉末，較難準(zhǔn)確稱(chēng)量，稱(chēng)量范圍可稍微放寬，但是不應(yīng)超過(guò)±20%，且該粉末較易氧化，使用后請(qǐng)旋緊管蓋，如試劑出現(xiàn)棕黃色，則需報(bào)廢或更換。
3.按照以下的表格進(jìn)行染色反應(yīng)液的配制：

4.每管加入配置好的檢測(cè)混合液，體積以覆蓋細(xì)胞為宜，充分重懸細(xì)胞，避光、室溫孵育10-30 min。
5.1000rpm 離心5 min，吸棄染色反應(yīng)液，每管加入2mL 0.5% Triton X-100細(xì)胞滲透液清洗2次，每次10 min；離心棄細(xì)胞滲透液，用500uL PBS重懸細(xì)胞。
DNA染色
1.將Hoechst 33342 *超級(jí)純*(李記貨號(hào)：AC12L021)用PBS溶液1:1000進(jìn)行稀釋得到1×Hoechst染色液。
2.每管加入1×Hoechst染色液，以覆蓋細(xì)胞為宜，室溫避光孵育10-15 min后，棄染色液。
3.加入500 μL PBS重懸細(xì)胞。
其它染色（自備）
（可選）可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體染色。染色完的樣品上機(jī)檢測(cè)時(shí)，根據(jù)使用的染料選擇合適的通道檢測(cè)。
流式檢測(cè)及分析
1.建議染色完成后立即進(jìn)行流式檢測(cè)；如果條件限制，請(qǐng)于4℃條件下避光濕潤(rùn)保存3 d之內(nèi)完成檢測(cè)。
2.檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量建議盡量能達(dá)到10⁷級(jí)，若細(xì)胞數(shù)量較少，檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量可調(diào)整為10⁶起始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。