非食用著色劑酸性橙Ⅱ，Acid Orange 7，染料索引號：C.I. 15510，是一種常用的工業(yè)染料，有強致癌性。因其色澤鮮艷、勻染性好、價格低廉等特點，酸性橙Ⅱ常被不法商家偷偷使用于食品生產(chǎn)加工，因而酸性橙Ⅱ被列入食品中禁用著色劑的檢測范圍。目前，國家已經(jīng)發(fā)布3個推薦性的食品中酸性橙Ⅱ?qū)Ｓ脵z測標準，但由于不同實驗室間儀器、人員、實驗耗材、樣品等條件存在差異，*執(zhí)行方法就能達到回收率、精密度要求的情況很少。因此，根據(jù)實際情況進行方法的優(yōu)化是必要的。
近，小編在用不同的基質(zhì)按照標準《SN/T 3536-2013 出口食品中酸性橙Ⅱ號的檢測方法》做酸性橙Ⅱ回收實驗時，發(fā)現(xiàn)回收率不很理想，而且6.1.2所規(guī)定的固態(tài)樣品前處理方法非常耗時（特別是凈化前提取液需“濃縮約至10mL”這一步）。因此小編依據(jù)標準方法對不同實驗環(huán)節(jié)進行了一些優(yōu)化，在這里將全過程分享給各位朋友以供參考交流~
樣品凈化步驟
樣品凈化步驟優(yōu)化涉及SPE小柱與濾膜的選擇、固相萃取操作步驟。
首先，我們需要按標準方法進行實驗，驗證所用SPE小柱與濾膜是否滿足當下實驗條件需求：
1. 根據(jù)標準3.6節(jié)（見下圖）選擇對應的SPE小柱。
由此，小編選擇了月旭Welchrom® NH2小柱（500mg/6ml,30pk，貨號：00509-11006）。
2. 使用酸性橙Ⅱ標準溶液，按標準6.1.3節(jié)的凈化方法（見下圖）進行固相萃取操作（小柱的活化方法見3.6），留取每一操作步驟的樣液用于上機檢測。
在這里，小編移取0.1mL 10mg/L酸性橙Ⅱ標準溶液，加10mL水混勻作為上樣溶液,并根據(jù)6.1.3分別收集上樣液、淋洗液、洗脫液、二次洗脫液進行上機檢測（此方法又稱“分步留樣”，是分析SPE操作過程中影響回收率的環(huán)節(jié)及原因的常用方法）。
3. 選擇合適的濾膜過濾樣液，上機檢測。
根據(jù)6.1.3，樣液上機前要過膜凈化。我們都知道，濾膜作用是凈化樣液，防止雜質(zhì)污染色譜柱。但使用濾膜（或使用不合適的濾膜）可能會影響目標物的回收率甚至引入雜峰。因此，小編嘗試了三種過膜方式：1) 不過膜；2) 水系濾膜；3) Nylon濾膜。
藍色為樣液不過膜，峰面積12.0191
粉色為樣液過水系濾膜，峰面積11.4695
黑色為樣液過Nylon濾膜，峰面積6.4975
結果發(fā)現(xiàn)過膜后，過膜樣液的圖譜峰面積：過Nylon濾膜＜過水系濾膜＜不過膜，說明過水系膜或有機系膜都對目標物造成一定損失。因此后續(xù)實驗的樣液均不過膜上機。建議本實驗樣液上機前不過膜。
后，小編發(fā)現(xiàn)上樣液、淋洗液以及兩次的洗脫液中都沒有目標物酸性橙Ⅱ檢出，酸性橙Ⅱ終的回收率已經(jīng)達到了95%-105%，滿足了檢測的要求。
樣品提取步驟優(yōu)化
其次，按照標準方法小編進行了空白基質(zhì)加標實驗，驗證樣品提取步驟是否影響不同基質(zhì)樣品中目標物的回收。實驗方法如下圖所示。
實驗過程中，小編發(fā)現(xiàn)：
6.1.2 固態(tài)試樣提取方法中提及：要用20mL乙醇-氨溶液（配制方法見3.4）提取2遍，再合并提取液，濃縮至10mL。
此時洗脫液總量約40mL，需40℃濃縮至10mL左右【相當于除去乙醇】。整個濃縮過程非常耗時，差不多處理一個樣要一小時，而且終的結果回收率非常不理想。
按照第yi次實驗的結果，小編進行了一些優(yōu)化，標準上是全部提取液濃縮至10mL左右后凈化，改為移取了其中20mL經(jīng)濃縮至約5mL后上樣。
根據(jù)第二次實驗結果，回收率已經(jīng)達到了90%-100%，滿足了檢測的要求。
終優(yōu)化后的實驗步驟和譜圖
一、提取
稱取樣品2g（±0.01g）于50mL離心管中，加入20mL乙醇-氨溶液，超聲提取30min，離心10min（4000r/min），吸取上清液于另一50mL離心管中；殘渣中加入20mL乙醇-氨溶液，重復提取一次，合并兩次上清液，混勻，準確移取20mL上清液，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少于5mL,轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，用水定容至10mL，待凈化。
二、凈化
SPE柱：月旭Welchrom® NH2規(guī)格：500 mg/6mL
活化：依次用5mL甲醇，5mL2%甲酸水溶液過柱，棄去流出液
上樣：將待凈化液全部上樣，自然流干，棄去流出液
淋洗：依次用5mL2%甲酸水溶液，再用5mL甲醇淋洗小柱，棄去流出液
洗脫：用5mL10%氨水甲醇溶液，收集于15mL試管中，抽干小柱
濃縮：氮吹至近干，用水定容至1mL,上HPLC檢測。
三、儀器條件
色譜柱：月旭Ultimate®XB-C18,4.6×250mm,5μm
流動相：乙酸銨：甲醇=35:65
柱溫：35℃
進樣量：20μL
檢測波長：484nm
流速：1.0mL/min
總結
在優(yōu)化標準方法的時候：
1）先選擇合適的SPE小柱，用目標物標準溶液進行固相萃取操作，分步排查SPE步驟，確認小柱與標準方法是否滿足具體要求；
2）再按標準方法，做空白基質(zhì)加標，確認前處理樣品提取步驟中目標物的損失情況，分析造成目標物損失的原因及步驟，有針對性優(yōu)化方法；
3）接著做樣品和樣加標，看目標物回收率情況，優(yōu)化提取量或提取次數(shù)；后得出一個穩(wěn)定的方法，保證滿足標準回收率要求進行檢測。
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