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雜質(zhì)分離方法開發(fā)過程
01 分析目的要求
開發(fā)一種合適的分析方法，使上述3種化合物在濃度1.0mg/mL的情況下分離度大于1.50。
開始方法開發(fā)之前，第一件該做的事是什么呢？
當然是去了解這幾個物質(zhì)的性質(zhì)，盡可能的得到有關(guān)這些物質(zhì)的信息，這樣可以為后面工作節(jié)省最多的時間。而對這三個物質(zhì)得到的信息大致如下：三種物質(zhì)極性比較強，水溶性比較好，在常規(guī)C18色譜柱保留太弱，基本上與溶劑峰重疊。結(jié)構(gòu)式上主要是官能團的差異，分別為-NH2，-Br，-COOH，差異性很大。
綜合考慮，有兩種方案：一是加離子對試劑，用反相C18色譜柱增強保留，進行分離；二是使用離子交換色譜柱進行分離。首先由于個人的習(xí)慣，離子交換色譜被我直接排除（離子色譜平衡比較慢，而且離子交換色譜柱非常容易出現(xiàn)重現(xiàn)性問題）。所以本實驗采用C18添加離子對試劑的方法。
考慮的實驗過程中需要使用離子對試劑，且流動相pH需要大范圍調(diào)整（可能用到堿性流動相），所以色譜柱選擇月旭Xtimate® C18（4.6×250mm，5μm）色譜柱，流速：1.0mL/min，柱溫30℃，檢測波長220nm。
2.1 初步嘗試流動相：0.05mol/L庚烷磺酸鈉+0.05mol/L磷酸二氫鉀，PH=4.60。
結(jié)果：化合物3保留時間2.6min，化合物1不出峰。估計是化合物1保留太強未洗脫下來。接下來，調(diào)整pH并增加有機相的比例，來加大洗脫能力。
2.2 流動相：緩沖液（1.00g辛烷磺酸鈉，10mM磷酸二氫鉀至500mL水中，用磷酸調(diào)pH=2.30）：甲醇=60：40。
混合對照圖譜如下：
實驗中將庚烷磺酸鈉改為辛烷磺酸鈉，增加有機相（甲醇）比例，結(jié)果三個物質(zhì)分離良好，但是化合物1（19.9分鐘）峰型太差，下一步優(yōu)化化合物1的峰型。
2.3 流動相：緩沖液（1.00g辛烷磺酸鈉，10mM磷酸二氫鉀至500mL水中，用磷酸調(diào)pH=2.30）：乙腈=80：20。
化合物1圖譜：
基于上一次實驗，將有機相甲醇變?yōu)橐译?，通過改變選擇性看是否峰型會有改善。結(jié)果發(fā)現(xiàn)并沒有任何改善，而且發(fā)現(xiàn)這個方法中有機相只提供洗脫能力，不提供選擇性改變作用。
2.4 流動相：緩沖液（緩沖液：1.00g十二烷基磺酸鈉，50mM氯化銨至500mL水，用磷酸調(diào)pH=1.80）：甲醇=60：40。
混合對照圖譜：
當時換成這個流動相的主要思路是，加十二烷基磺酸鈉使保留更強，加氯化銨提高離子濃度，調(diào)pH至1.80強酸性使化合物1中-NH2官能團作用更弱，達到優(yōu)化峰型的目的，但是效果很差。回頭總結(jié)發(fā)現(xiàn)我們所有的目光都聚焦在三種物質(zhì)的不同官能團上，導(dǎo)致越走越偏離分離的軌跡，這里，三個物質(zhì)共同含有的官能團可能也是影響分離的主要因素，換了個角度后，豁然開朗了。tui翻了之前的方案，將離子對試劑換為四丁基氫氧化銨，從頭開始。
2.5 流動相：緩沖液（4mL 10%四丁基氫氧化銨水溶液，1.36g磷酸二氫鉀至500mL水中，用三乙胺調(diào)pH=9.30）：乙腈=80：20。
混合對照圖譜：
流動相中添加三乙胺和并將pH調(diào)成9.3目的是抑制化合物1的拖尾，但是結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種物質(zhì)沒有分開。繼續(xù)優(yōu)化條件將pH值降低。
2.6 流動相：緩沖液（4mL 10%四丁基氫氧化銨水溶液，1.36g磷酸二氫鉀至500mL水中，用三乙胺調(diào)pH=7.00）：乙腈=80：20。
混合對照圖譜：
看到這結(jié)果是不是項目就OK了。但是既然是方法開發(fā)，方法重現(xiàn)性實驗實驗是bi不可少的，需要用一根新色譜柱重現(xiàn)該色譜條件。
結(jié)果問題就來了.....
化合物1圖譜：
化合物1峰型一直分叉，最終發(fā)現(xiàn)應(yīng)該是色譜柱使用多種離子對試劑，造成色譜柱改性，新色譜柱不能重現(xiàn)結(jié)果。好吧，再開始。
然后又是繼續(xù)摸索。不得不說有時候運氣也是成功的一部分，在一次流動相配置過程中，看到四丁基氫氧化銨試劑旁邊還有一瓶四丁基溴化銨，突然我就冒出想法，用四丁基溴化銨試試，不知道結(jié)果會怎么樣，說做就做。
2.7 流動相：緩沖液（1.00g四丁基溴化銨，1.36g磷酸二氫鉀，1.0mL三乙胺至500mL高純水。用磷酸調(diào)節(jié)pH=7.10）：乙腈=80：20。
混合對照圖譜：
03 結(jié)果
結(jié)果：分離度，峰型都滿足要求，wan美。當然還是需要重現(xiàn)方法的。
三根新色譜柱重現(xiàn)結(jié)果：
最終色譜條件：
色譜柱：月旭Xtimate® C18（4.6*250mm，5μm）。
流動相：緩沖液（1.00g四丁基溴化銨，1.36g磷酸二氫鉀，1.0mL三乙胺至500mL高純水。用磷酸調(diào)節(jié)pH=7.10）：乙腈=80：20
檢測波長：220nm；
柱溫：30℃；
流速：1mL/min；
進樣體積：10μL。
搞定交差！
04 實驗小結(jié)
在液相應(yīng)用方法開發(fā)過程中，首先需結(jié)合需要分離的目的，確定思路，一個方法最初的思路，是決定這個方法開發(fā)的效果，效率的最根本因素；其次是細節(jié)，任何細節(jié)都有可能導(dǎo)致你實驗的成功與否；最后是運氣，牛頓發(fā)現(xiàn)萬有引力還有運氣成分呢，說不定你是下一個。
同時，在一個方法確定好之后，一定需要使用一根新的色譜柱來驗證，因為在方法開發(fā)過程中，我們會使用到各種流動相條件，會對色譜柱一個改性，特別是使用離子對試劑的方法，否則后續(xù)的重現(xiàn)性問題會是一個非常頭痛的事情。