A54分子作為一種生物導(dǎo)向肽，對(duì)人肝BEL-7402細(xì)胞具有*的親和性。以化學(xué)共沉淀法合成出磁性納米顆粒，通過(guò)氫鍵及共價(jià)鍵合的作用將綠色熒光蛋白標(biāo)記的導(dǎo)向肽(A54-GFP)修飾結(jié)合在磁性納米顆粒表面。采用透射電鏡和穆斯堡爾譜儀表征了磁性納米顆粒的形貌和結(jié)構(gòu);紅外光譜了A54-GFP分子與磁性納米顆粒的結(jié)合;通過(guò)等溫吸附實(shí)驗(yàn)研究了兩者的結(jié)合率。

1.生物導(dǎo)向肽在磁性納米顆粒表面的結(jié)合

磁性納米顆粒采用化學(xué)共沉淀方法合成。相同濃度(O.6mg/mL)的A54-GFP溶液分為兩組，樣品（SA1)為A54-GFP初始溶液，組樣品(SA2)加入碳二亞胺溶液使其活化。分別移取量的磁性液體加入磷酸鹽緩沖溶液PBS中，聲分散使之成為穩(wěn)定的懸浮液;而后加入A54-GFP樣品中，混合溶液用PBS稀釋，繼續(xù)聲分散;而后將樣品放入恒溫振蕩器中于20℃避光振蕩24h，直至吸附平衡。室溫下用冷凍離心機(jī)分離樣品，上層清液用于多肽濃度分析，分離出的粒子用于其他測(cè)試。

2.生物導(dǎo)向肽從磁性納米顆粒表面的脫附

A54-GFP從磁性納米顆粒表面的脫附實(shí)驗(yàn)是在兩種緩沖溶液Tris-HC1(pH=9.15)和 NaHPOz-Citrate (pH=4.20)中進(jìn)行的。將表面結(jié)合有A54-GFP的磁性納米顆粒離心分離后分別加入0.5mL兩種緩沖溶液中，20℃恒溫振蕩2h后，分離樣品，取上層清液分析多肽的濃度。

Fe3O4納米顆粒的形貌如圖1所示，從圖中可看出由化學(xué)共沉淀方法制備的Fe3O4納米顆粒主要為球形結(jié)構(gòu)，粒子的直徑均為5~20nm，平均粒徑約為12nm。BET測(cè)試得到的粒子的比表面積為103.8481m2/g，計(jì)算得到的平均粒徑為11nm，與 TEM 數(shù)據(jù)相當(dāng)。

3.導(dǎo)向肽在磁性納米顆粒表面的結(jié)合

圖2為磁性Fe3O4顆粒(a)和表面結(jié)合有A54-GFP分子的磁性顆粒(b)的紅外光譜圖。圖2(a)中 572cm1為Fe3O4顆粒中Fe--O鍵的特征吸收峰,當(dāng)A54-GFP分子與顆粒結(jié)合后，此吸收峰紅移至580cm'，說(shuō)明A54-GFP分子終端基團(tuán)中的原子與磁性顆粒表面的Fe原子進(jìn)行了配位。圖2(b)中，2925cm'、2960cm'為C一H鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰;1653cm'、1540cm'、1456cm'處的吸收峰分別對(duì)應(yīng)于A54-GFP中酰胺I、II、IⅢI譜帶l6~7];1069cm1對(duì)應(yīng)C一N鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰。以上特征吸收峰的出現(xiàn)，磁性納米顆粒表面修飾結(jié)合有量的A54-GFP分子。此外，圖2(a)中 3442cm'為磁性顆粒表面的羥基一OH伸縮振動(dòng)吸收峰，而表面結(jié)合有A54-GFP分子的磁性顆粒紅外光譜中此峰峰形變寬，吸收強(qiáng)度，并發(fā)生的紅移，說(shuō)明A54-GFP分子中一OH氫與磁性顆粒表面的O原子形成了氫鍵。

與綠色熒光蛋白標(biāo)記的導(dǎo)向肽A54-GFP結(jié)合后磁性納米顆粒的光學(xué)熒光顯微鏡照片如圖3所示。從圖中可看出，在藍(lán)光激發(fā)下，分散的磁性納米顆粒團(tuán)表面具有很強(qiáng)的綠色熒光，表明綠色熒光蛋白標(biāo)記的導(dǎo)向肽成功地修飾結(jié)合在磁性納米顆粒表面。

為了研究生物導(dǎo)向肽在磁性納米顆粒上的結(jié)合量，進(jìn)行了等溫吸附實(shí)驗(yàn)。圖4給出了A54-GFP在Fe3O4納米顆粒表面的吸附等溫線，從圖中可看出兩組樣品在磁性納米顆粒表面的吸附均已趨近飽和,采用Langmuir方程對(duì)吸附等溫線進(jìn)行了擬合，Langmuir方程為:

由于Fe3O4納米顆粒表面羥基一OH，因而部分A54-GFP分子可與Fe3O4納米顆粒表面的羥基形成氫鍵，前述紅外光譜中羥基一OH伸縮振動(dòng)吸收峰的寬化氫鍵的形成。

相對(duì)于樣品組SA1，樣品組SA2經(jīng)碳二亞胺活化后在磁性納米顆粒表面的結(jié)合量有量的,可能的機(jī)理是碳二亞胺活化了溶液中A54-GFP分子中的終端羧基--COOH，使之與磁性納米顆粒的表面的羥基一OH以羧酸酯的形式共價(jià)結(jié)合。

為了這種推斷，進(jìn)行了脫附實(shí)驗(yàn)。表2給出了A54-GFP從磁性納米顆粒表面的脫附數(shù)據(jù)，由于堿性條件下溶液中含有量的OH―，導(dǎo)致部分氫鍵的斷裂，因而樣品組SA1的樣品在Tris-HCl(pH=9.15)緩沖液中的洗脫量(41.33%）大于在磷酸氫二鈉-檸檬酸( pH=4.20）緩沖液中的洗脫量(9.72%);相對(duì)而言,樣品組SA2的樣品洗脫量在弱酸弱堿兩種緩沖溶液中的洗脫量均較小，說(shuō)明經(jīng)碳二亞胺活化后，A54-GFP分子主要以化學(xué)成鍵的形式結(jié)合在磁性納米顆粒表面，同時(shí)了其吸附結(jié)合量。

4.磁性能測(cè)試

圖5為磁性納米顆粒與A54-GFP分子結(jié)合前后室溫下的磁化曲線，Fe3O4納米顆粒的比飽和磁化強(qiáng)度M,、剩余磁化強(qiáng)度M,和矯頑力H分別為61emu/g、3emu/g、290e;與A54-GFP結(jié)合后樣品的比飽和磁化強(qiáng)度M,、剩余磁化強(qiáng)度M和矯頑力Hc分別為47emu/g、2emu/g、230e。

采用化學(xué)共沉淀法制備出平均粒徑為12nm的磁性Fe3O4顆粒。利用吸附的方法直接將綠色熒光蛋白標(biāo)記的導(dǎo)向肽A54-GFP修飾結(jié)合在磁性納米顆粒的表面，Langmuir方程擬合的吸附等溫線結(jié)果證明A54-GFP在磁性納米顆粒表面的結(jié)合以單分子層為主，兩者的結(jié)合主要通過(guò)氫鍵和共價(jià)鍵實(shí)現(xiàn)。磁性能測(cè)試表明與A54-GFP結(jié)合后樣品趨近于順磁狀態(tài)，比飽和磁化強(qiáng)度47emu/g。這種基于磁性顆粒和生物導(dǎo)向肽的多功能納米顆粒（磁性和生物性）可望用于磁熱療、核磁共振造影成像、細(xì)胞分離與純化以及靶向科研等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

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