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使用EVIDENT共聚焦顯微鏡對血管化腫瘤細(xì)胞球芯片進(jìn)行觀察研究

閱讀：82 發(fā)布時間：2025-3-7
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研究顯示，腫瘤可通過誘導(dǎo)血管生長來支持其旺盛的活性。這些血管作為腫瘤的生命線，在腫瘤微環(huán)境（TME）中對于其活性起到了相當(dāng)重要的作用。到目前為止，對腫瘤在生化和生物力學(xué)刺激的反應(yīng)，大多是在靜態(tài)條件下進(jìn)行評估，并沒有考慮到血流對腫瘤的影響。本篇文章，我們提供了一個腫瘤-芯片平臺，通過流經(jīng)可灌注血管網(wǎng)絡(luò)的介質(zhì)流來評估腫瘤微環(huán)境，并測量血流中的給藥效應(yīng)。

圖1.微流控設(shè)備和腫瘤模型。（左）微流控設(shè)備圖；（右）具有可灌注血管網(wǎng)絡(luò)的腫瘤模型。

腫瘤細(xì)胞球在微流控設(shè)備中的3D觀察結(jié)果
本研究中，我們在微流控設(shè)備中將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）與含有人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）的腫瘤細(xì)胞球進(jìn)行共同培養(yǎng)，以重現(xiàn)包括血管網(wǎng)絡(luò)在內(nèi)的腫瘤微環(huán)境。為了確認(rèn)微流控設(shè)備中血管網(wǎng)絡(luò)的可灌注性，我們使用FLUOVIEW共聚焦顯微鏡觀察熒光微球（綠色）是否能夠連續(xù)通過血管網(wǎng)絡(luò)和球細(xì)胞。因細(xì)胞球較厚，我們很難獲得培養(yǎng)樣本的三維圖像。通常需要較高的激發(fā)光強度才能產(chǎn)生足以能夠檢測到的熒光信號強度。
但是，較高的激發(fā)光強度也會增大光毒性，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。為了解決這一問題，我們使用集成了TruSpectral全真光譜檢測技術(shù)和高靈敏度GaAsP探測器的FLUOVIEW共聚焦顯微鏡，捕獲微弱的熒光信號，同時盡量降低激光器的功率。

圖2.腫瘤細(xì)胞球及其血管網(wǎng)絡(luò)。細(xì)胞核：青色（405 nm，Hoechst 33342），RFP-HUVEC：紫紅色（561 nm，RFP），E-鈣粘蛋白：黃色（640 nm，Alexa Fluor 633）。

(a) 腫瘤細(xì)胞球的投影圖。比例尺：200 μm，物鏡：UPLSAPO10X2。（b）（a）中白色框架的3平面圖像（x-y、x-z、y-z）。比例尺：20 μm，物鏡：UPLSAPO40X2。
使用共振掃描振鏡進(jìn)行血流快速成像
我們還利用熒光微球（綠色，直徑3.1 μm）檢查了腫瘤細(xì)胞球血管網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的血流。在觀察快速血流時，常規(guī)掃描振鏡的掃描速度可能不夠。本實驗中，我們使用配有高速共振掃描振鏡的FLUOVIEW共聚焦顯微鏡采集圖像。
結(jié)果表明，在將熒光微球注入到微流控設(shè)備的通道3時，微球流經(jīng)腫瘤細(xì)胞球的中空腔并到達(dá)通道1，說明我們所設(shè)計的血管網(wǎng)絡(luò)可接受灌注。確認(rèn)人工腫瘤細(xì)胞球模型用于研究血流對TME影響的有效性后，我們在隨后的實驗中明確了，在包括血管網(wǎng)絡(luò)的TME中，藥物的療效因血管內(nèi)是否存在血流而異。我們希望這款三維模型能夠在今后被用作經(jīng)血管給藥模型，以協(xié)助藥物的開發(fā)。

視頻：微流控設(shè)備上人造血管和腫瘤細(xì)胞球內(nèi)熒光微球的流動。成像條件：65 毫秒/幀。比例尺：100 μm。

這項研究的新穎之處在于，在腫瘤細(xì)胞球內(nèi)，人工構(gòu)建的可灌注血管網(wǎng)絡(luò)。可視化血管網(wǎng)絡(luò)如何連接細(xì)胞球和微流控通道非常重要。此外，可以同時觀察血管管腔和流經(jīng)血管結(jié)構(gòu)的血流，對于證明其可灌注性來說也很關(guān)鍵。FLUOVIEW共聚焦顯微鏡上安裝的高速共振掃描振鏡，能夠?qū)ρ芫W(wǎng)絡(luò)（RFP標(biāo)記）和微球（綠色）動態(tài)流進(jìn)行成像。

——Ryuji Yokokawa博士
日本京都大學(xué)微工程系

腫瘤學(xué)研究和藥物研發(fā)對顯微成像的要求非常高，需要有高速的三維成像能力，在體的研究還需要低光度性的深層成像，Evident全新激光掃描共聚焦顯微鏡和多光子顯微鏡FV4000（MPE）配備全新的高靈敏硅基半導(dǎo)體檢測器，具有更高的靈敏度，降低了光毒性，同時高分辨率的共振掃描振鏡可提供視頻級采集速率，幫助獲取腫瘤微環(huán)境或藥物代謝的動態(tài)變化過程。
左圖：FV4000激光掃描共聚焦顯微鏡；右圖：FV4000MPE多光子顯微鏡

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