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　　1.概述
 

　　液相色譜系統(tǒng)由泵及流路系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜柱系統(tǒng)以及檢測器系統(tǒng)構(gòu)成，其中進(jìn)樣系統(tǒng)可細(xì)分為手動進(jìn)樣與自動進(jìn)樣，兩種進(jìn)樣方式均要求進(jìn)樣的準(zhǔn)確性與精密度。其中手動進(jìn)樣系統(tǒng)由于人為因素對進(jìn)樣的準(zhǔn)確性有很多大的影響，如人員的手動進(jìn)樣熟練程度等，漸漸退出市場。而自動進(jìn)樣系統(tǒng)，由于具有很高的準(zhǔn)確度以及精密度，幾乎排除人員因素的影響以及具有高通量、自動運(yùn)行序列等特點(diǎn)而成為HPLC系統(tǒng)的標(biāo)配。
 

　　液相色譜進(jìn)樣系統(tǒng)位于泵后，色譜柱之前的高壓區(qū)域，如下圖所示。流動相混合之后流經(jīng)進(jìn)樣系統(tǒng)，將樣品溶液帶入到色譜柱內(nèi)，完成進(jìn)樣。
 

　　2.進(jìn)樣系統(tǒng)構(gòu)成
 

　　進(jìn)樣系統(tǒng)一般由進(jìn)樣針、注射器或者計量泵、樣品托盤、定量環(huán)以及閥構(gòu)成，其中閥是整個進(jìn)樣系統(tǒng)的核心，通過閥的切換做到在進(jìn)樣的過程中不停泵，保持流動相持續(xù)不斷地流經(jīng)色譜柱。進(jìn)樣閥(六通閥)的典型結(jié)構(gòu)如下圖2所示，主要由定子以及轉(zhuǎn)子構(gòu)成，定子與定子面緊密接觸，其上的六個孔洞分別連接泵流路的方向，色譜柱，定量環(huán)，進(jìn)樣針或進(jìn)樣針座以及廢液接口。
 

　　在工作時，定子面(多為不銹鋼)，定子(多為陶瓷)以及轉(zhuǎn)子密封(多為聚合物)三者之間緊密接觸，由電動馬達(dá)(手動進(jìn)樣裝置有把手連接轉(zhuǎn)子)帶動轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣狀態(tài)的改變。轉(zhuǎn)子密封的材質(zhì)一般為聚合物，不同材質(zhì)的轉(zhuǎn)子密封具有不同耐受環(huán)境限制，如聚酰亞胺材質(zhì)的轉(zhuǎn)子密封最大耐受的pH為10，若體系流動相pH超過10的時候，就需要使用其他材質(zhì)如乙烯-四氟乙烯共聚物或聚醚醚酮聚合物材質(zhì)的轉(zhuǎn)子密封，不同材質(zhì)的轉(zhuǎn)子密封的耐受pH范圍。
 

　　轉(zhuǎn)子密封上面有弧狀的凹槽，其作用是通過轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)動將定子上的不同孔洞之間形成通路，一般有兩種形式。
 

　　轉(zhuǎn)子密封上有兩條凹槽，適用與手動進(jìn)樣裝置，在進(jìn)樣時通過轉(zhuǎn)動手柄或把手，實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣閥在loading位與injection位的切換。圖B所示轉(zhuǎn)子密封上有三條凹槽，適用于自動進(jìn)樣裝置。
 

　　3.手動進(jìn)樣
 

　　手動進(jìn)樣方式對于人員的熟練程度比較高，其基本流程如下。為loading位，此時流動相直接通過定子與轉(zhuǎn)子與色譜柱相接，通過注射針將樣品注入定量環(huán)；為injection位，此時通過轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動，將泵、定量環(huán)、色譜柱形成一個通路，樣品溶液在流動相的流動下帶入到色譜柱。此時，與注射針相連接的定子上的孔徑與廢液相接，可注入溶劑或Blank進(jìn)行沖洗進(jìn)樣管路。
 

　　從其進(jìn)樣方式，還可以看出樣品進(jìn)入定量環(huán)的方向與樣品進(jìn)入色譜柱的方向是相反的。如果是滿環(huán)進(jìn)樣的話，前后的方向是否相反，其影響基本可以忽略；但在非滿環(huán)進(jìn)樣的情況下，前后方向相反，可以盡可能多的減少樣品在色譜柱外的柱外擴(kuò)展作用。
 

　　此外，在進(jìn)樣完成之后，可不必急于將進(jìn)樣閥搬回loading位，依靠流動相的流動將定量環(huán)充分的沖洗之后，再搬回原位，為下一針做準(zhǔn)備。
 

　　手動進(jìn)樣有兩種方式，滿環(huán)進(jìn)樣與非滿環(huán)進(jìn)樣方式。在滿環(huán)進(jìn)樣的時候，注射器像定量環(huán)注入大于滿環(huán)體積的樣品溶液，多余的樣品溶液進(jìn)入廢液。非滿環(huán)進(jìn)樣方式，要求進(jìn)樣體積小于滿環(huán)體積的一半，兩種進(jìn)樣方式的區(qū)別。
 

　　此外，對于非滿環(huán)進(jìn)樣，之所以要求進(jìn)樣體積小于滿環(huán)體積的一半是因?yàn)?，在非滿環(huán)條件下，定量環(huán)內(nèi)存在兩種溶液，一是流動相，二是樣品溶液。樣品溶液在注入到定量環(huán)中的時候與流動相發(fā)生混合而被稀釋，一般地，1微升的樣品溶液會被稀釋為2微升。因此，非滿環(huán)進(jìn)樣時，進(jìn)樣體積最好小于滿環(huán)體積的一半。
 

　　4.自動進(jìn)樣
 

　　自動進(jìn)樣時，連接轉(zhuǎn)子的手柄或把手被電動馬達(dá)所代替，實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣閥相位的改變。自動進(jìn)樣一般有三種模式，分別為吸入式自動進(jìn)樣，推入式自動進(jìn)樣以及一體式自動進(jìn)樣。不同的自動進(jìn)樣方式具有不同的有點(diǎn)，同時也各自具有不同的缺點(diǎn)。
 

　　4.1吸入式自動進(jìn)樣
 

　　吸入式自動進(jìn)樣，亦即通過抽拉注射器將樣品溶液吸入到定量環(huán)中，首先是進(jìn)樣閥處于injection相位(圖7A)，流動相從混合之后通過定量環(huán)進(jìn)入色譜柱。進(jìn)樣程序開始時，進(jìn)樣閥相位調(diào)整到loading位(圖7B)，樣品在負(fù)壓的作用下進(jìn)入定量環(huán)，之后進(jìn)樣閥重新調(diào)整到injection相位，樣品溶液隨流動相進(jìn)入色譜柱。
 

　　當(dāng)泵、定量環(huán)以及色譜柱之間形成通路的同時，針筒以及管路中的樣品被排入廢液，如圖8A所示；之后切換到loading位置，針筒抽吸洗針液對定量環(huán)進(jìn)行清洗，如圖8B所示。
 

　　吸入式自動進(jìn)樣器，由于機(jī)械結(jié)構(gòu)簡單，因而易于維護(hù)以及便于排除故障，但較浪費(fèi)樣品。
 

　　4.2推入式自動進(jìn)樣
 

　　推入式自動進(jìn)樣，進(jìn)樣閥處于injection相位的時候，流動相、定量環(huán)以及色譜柱構(gòu)成一個完整的通路，此時進(jìn)樣針座與廢液聯(lián)通。樣品經(jīng)計量泵拉入臨時定量環(huán)中，如圖9A所示；之后進(jìn)樣閥切換到loading相位，進(jìn)樣針與針座連接，而針座與定量環(huán)連接，通過計量泵將樣品溶液推入到定量環(huán)中，如圖9B所示。
 

　　之后進(jìn)樣閥再次切換到injection相位，流動相、定量環(huán)以及色譜柱構(gòu)成一個完整的通路，樣品溶液隨流動相進(jìn)入色譜柱中。臨時定量環(huán)中的樣品溶液被排放入廢液，如圖10所示。
 

　　在injection相位下，計量泵泵入洗針液，之后進(jìn)樣閥切換到loading相位，進(jìn)樣針座與定量環(huán)聯(lián)通，對定量環(huán)以及進(jìn)樣針進(jìn)行清洗，并經(jīng)廢液排出，如圖11B所示。
 

　　推入式自動進(jìn)樣器具有進(jìn)樣體積靈活可調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，相比吸入式自動進(jìn)樣器，樣品消耗較??；同時樣品經(jīng)進(jìn)樣針座進(jìn)入定量環(huán)的過程為低壓過程，便于控制以及對相關(guān)部位進(jìn)行密封。由于其機(jī)械結(jié)構(gòu)相比吸入式自動進(jìn)樣器復(fù)雜，發(fā)生故障時，不易于排除。
 

　　4.3一體式自動進(jìn)樣
 

　　一體式自動進(jìn)樣器的不同點(diǎn)在于進(jìn)樣針與定量環(huán)是一個整體。如同推入式自動進(jìn)樣器一樣，首先進(jìn)樣閥處于injection相位，流動相經(jīng)泵后與定量環(huán)及進(jìn)樣針、進(jìn)樣針座以及色譜柱形成通路，如圖12A所示。之后進(jìn)樣閥切換到loading相位，樣品溶液隨著柱塞桿的拉出而進(jìn)入到定量環(huán)中，此時流動相經(jīng)泵之后直接與色譜柱相連。
 

　　進(jìn)樣時，進(jìn)樣閥重新切換回injection相位，樣品進(jìn)入色譜柱。之后，在下次進(jìn)樣之前一直處于該相位，以流動相對定量環(huán)以及取樣針進(jìn)行沖洗。
 

　　該種進(jìn)樣方式具有很少浪費(fèi)樣品，甚至不浪費(fèi)樣品的特點(diǎn)，特別適合于樣品量比較少的情況；同時由于方法運(yùn)行的絕大部分時間，進(jìn)樣閥均處于injection相位對定量環(huán)及進(jìn)樣針進(jìn)行沖洗，樣品殘留的可能性大大降低。由于進(jìn)樣針座處于HPLC系統(tǒng)的高壓處，對于連接處的密封性要求高，且該種方式的最大進(jìn)樣量也受到定量環(huán)大小的限制。
 

　　5.相關(guān)問題
 

　　這里只涉及進(jìn)樣針樣品殘留以及系統(tǒng)污染兩種情形。
 

　　在相關(guān)色譜峰之間出現(xiàn)了一個峰寬異常(大于前后兩個色譜峰的峰寬)的色譜峰，這種情形一般是系統(tǒng)污染(色譜柱上的強(qiáng)保留成分)引起的；如圖14B所示在前后兩個色譜峰之間出現(xiàn)了峰寬與前后色譜峰峰寬差不多的色譜峰，這種情形一般是由于樣品污染(或者進(jìn)樣針或針座被污染)引起的。
 

　　此外值得注意的一點(diǎn)是，當(dāng)進(jìn)樣閥的轉(zhuǎn)子密封墊上的凹槽隨著使用時間的加長以及磨損，進(jìn)而使得凹槽內(nèi)部形成一定的死角，這種情況下易于發(fā)生樣品殘留現(xiàn)象；若不同的凹槽之間發(fā)生交聯(lián)時，會引起漏液；若凹槽由于磨損而變寬的話，會引起色譜峰變寬，色譜柱的表觀柱效降低。
 

　　6.結(jié)論
 

　　進(jìn)樣系統(tǒng)是HPLC的重要組成部分，其中手動進(jìn)樣方式要求操作人員進(jìn)樣技術(shù)嫻熟，人為因素影響分析結(jié)果的可能性比較大；自動進(jìn)樣器可以很好的解決進(jìn)樣重復(fù)性、準(zhǔn)確性問題，不受人為因素影響，同時還能夠?qū)崿F(xiàn)通量操作。不同的自動進(jìn)樣器具有不同的有點(diǎn)的同時也難免有一定的缺點(diǎn)，其中推入式以及一體式自動進(jìn)樣器是應(yīng)用較為廣泛的兩種自動進(jìn)樣器。