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流式干細(xì)胞實驗中熒光染料如何選擇
(1)確定熒光染料本身所適合的流式干細(xì)胞儀,需要了解染料的激發(fā)波長和發(fā)射波長、儀器所配制的檢測濾光片和激發(fā)光源。
(2)了解熒光素的相對熒光強(qiáng)度:相對熒光強(qiáng)度反映的是熒光素-單抗結(jié)合物的亮度,其判斷標(biāo)準(zhǔn)是染色指數(shù)。影響相對熒光強(qiáng)度的因素包括:不同儀器的激光及濾片組合不同,熒光素的相對熒光強(qiáng)度不同;抗體上熒光素分子的多少會影響相對的熒光強(qiáng)度。
(3)選擇原則:考慮抗原的密度【高密度表達(dá)的抗原可考慮選擇幾乎所有的熒光素;低密度表達(dá)的抗原需要可提供較高S/N比值的熒光素,如PE/APC?!?;自發(fā)熒光【每種干細(xì)胞群都有不同水平的自發(fā)熒光,所有的熒光通道均可觀察的自發(fā)熒光,但自發(fā)熒光強(qiáng)度在波長較長時迅速降低。對自發(fā)熒光較強(qiáng)的細(xì)胞,選擇發(fā)射波長長的熒光素(APC)可得到較好的S/N比值,對于自發(fā)熒光強(qiáng)度弱的細(xì)胞,發(fā)射波長長的熒光素對S/N提高沒有明顯的改善,可選用FITC?!?;非特異性結(jié)合;復(fù)合染料【避免信號衰退。復(fù)合染料因為光、固定劑或溫度升高會導(dǎo)致信號衰退,使復(fù)合染料在上一級染料處發(fā)光。減少樣本暴露于光、高溫或固定劑,可很大程度上避免這一問題。若樣本需要固定,要選擇穩(wěn)定的固定劑,可有效阻止復(fù)合染料的信號衰退。盡量減少信號間的干擾,檢測的顏色越多,面臨的信號干擾越多,選擇試劑時盡可能降低熒光發(fā)射波長間的重疊?!?。
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