蛋白酶抑制劑混合物片劑(無(wú)EDTA)操作步驟：

1  切取含有目的DNA 片段的瓊脂糖凝膠條帶。

● 盡量切除不含有目的DNA 部分的凝膠，減少凝膠體積，提高DNA 回收率。

● 切膠時(shí)，請(qǐng)使用長(zhǎng)波長(zhǎng)UV  （360 nm ）光盒。且不要將DNA 長(zhǎng)時(shí)間暴露在紫外燈下，以防DNA 損傷。

2  稱取凝膠的重量近似地確定其體積。

● 凝膠重量的稱量方法：取1.5 ml 離心管電子天平稱初質(zhì)量，切膠裝在離心管后稱終質(zhì)量，兩者差即為膠的質(zhì)量。不同離心管的重量可能有差異，因此，每個(gè)離心管的重量需單獨(dú)稱量。

3  按照每100 mg 瓊脂糖凝膠對(duì)應(yīng)100 µl 溶液BD 的比例，向離心管中加入溶液BD。

4  50 ℃水浴7-10min，直至凝膠*溶化。期間需要振蕩混合3 次。

● 瓊脂糖必須*融化，以免堵塞柱子，嚴(yán)重影響DNA 片段的回收效率。

● 如果總體積大于500 µl，可適當(dāng)增加溶膠時(shí)間。

● 若此時(shí)溶液變紅，可加10 µl 3M NaAC  （pH 5.2）。

5  將步驟4 所獲溶液置于DNA 純化柱中，靜置2min 。

● 膠塊*溶解后最好將膠溶液溫度降至室溫再上柱，因?yàn)榧兓谳^高溫度時(shí)結(jié)合DNA  的能力較弱。

6  12,000 rpm 離心1min。若溶液量大于DNA 純化柱的容積，可分兩次離心，棄濾液。

● 此時(shí)DNA 片段被吸附于DNA 純化柱中的硅膠膜上。

7  加入500 µl 溶液BD。12,000 rpm,  離心1min，棄濾液

8  加入500 µl 溶液PE。12,000 rpm,  離心1min，棄濾液。

● 溶液PE 初次使用前用無(wú)水乙醇按1: 4 稀釋，即含80% 乙醇。

● 此步驟的作用是將硅膠膜上吸附的蛋白、鹽等雜質(zhì)洗脫，以獲得高質(zhì)量DNA 片段。

9  加入500 µl 溶液PE。12,000 rpm,  離心1min，棄濾液。

10 12,000 rpm 離心  3min ，以*去除純化柱中的液體。

● 此步驟的作用是去除殘留乙醇，避免殘留乙醇影響后續(xù)酶促反應(yīng)。同時(shí)也利于DNA 片段的充分溶解。

11  將離心柱置于新的1.5 ml 離心管中。向純化柱的中央處，懸空滴加30-100 µl 溶液Eluent  （60℃預(yù)熱），靜置2min 。12,000 rpm  離心1min，管底即為目的DNA 片段。貯存于-20℃。

● 溶液Eluent 可用無(wú)菌雙蒸水代替，但其pH 需為8.0-8.5，加入體積視DNA 目的片段的多少、用戶對(duì)目的片段濃度要求而定。

● 對(duì)溶液Eluent 60℃預(yù)熱，會(huì)提高提取DNA 目的片段的產(chǎn)量。

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