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            細胞電穿孔轉(zhuǎn)染操作步驟

            時間:2017/2/28閱讀:4290
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            原代細胞對于細胞轉(zhuǎn)染而言,目前主要是轉(zhuǎn)染試劑(多為脂質(zhì)體)的天下。磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方法雖說有些out,但有些細胞還就認準這一套。不過,對于某些淋巴細胞而言,化學(xué)方法怎么都不奏效,那我們只能采取強硬手段,用電穿孔的方法進行轉(zhuǎn)染。

            應(yīng)用電穿孔時,一般都選擇恒定的電容,然后在不同的場強下轟擊細胞,以摸索*實驗條件。就大多數(shù)細胞而言,在電穿孔后能有20-50%的細胞存活率就OK,足以保證DNA的成功轉(zhuǎn)染。電穿孔通常在室溫下進行,之后將細胞置于冰上,以延長原代細胞膜孔道開放的時間。

            與傳統(tǒng)的磷酸鈣和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染相比,電穿孔具有操作簡便、轉(zhuǎn)染效率高等諸多優(yōu)點。但它也受多種因素的影響。電壓太低時,細胞膜的改變不足以允許DNA分子通過,而電壓過高時又會造成細胞的損傷。這也就是常說的對細胞毒性大。因此轉(zhuǎn)染時所需的細胞要比其他方法更多。同時,轉(zhuǎn)染時所需的DNA也更多。如果想要穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的話,將DNA線性化后可能效果更好,因為線性DNA更容易整合到基因組DNA上。其他條件如緩沖液、轉(zhuǎn)染溫度等也會對轉(zhuǎn)染效果產(chǎn)生影響。

            由于貼壁細胞必須附著在培養(yǎng)瓶的表面才能生長,因此懸浮細胞更易通過電穿孔方法進行轉(zhuǎn)染。不過,不同細胞間的*轉(zhuǎn)染參數(shù)變異較大,需要不斷摸索。如果有優(yōu)化好的轉(zhuǎn)染步驟用來參考,那就不過了。

            Bio-Rad公司zui近就新發(fā)布了12種原代細胞和細胞系的電穿孔步驟,幫你節(jié)省了優(yōu)化的時間。這些細胞包括T細胞、嗜中性粒細胞和幾種B細胞淋巴瘤。除了這12種細胞,數(shù)據(jù)庫中還包括了很多常用細胞系如293、3T3、CHO的電穿孔步驟。這些步驟包括了優(yōu)化過的電壓、電容、細胞密度、電轉(zhuǎn)緩沖液等,是在Bio-Rad 公司Gene Pulser Mxcell電穿孔系統(tǒng)和Gene Pulser緩沖液的基礎(chǔ)上進行開發(fā)的。

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