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            科研細胞
            天然蛋白、重組蛋白

            神經(jīng)細胞分散培養(yǎng)

            時間:2017/4/18閱讀:471
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            (一) 細胞系選材 常用胚胎動物或新生鼠神經(jīng)組織。雞胚常用胚齡6-8d,新生鼠或胎鼠(12-14d)或人胚胎。不過也有認(rèn)為與組織相關(guān)。如大白鼠胚胎以19d為宜,小鼠以18d為宜,大鼠紋狀體以10d為宜;若紋狀體與黑質(zhì)聯(lián)合培養(yǎng)的大鼠胚,則黑質(zhì)以13d,紋狀體18-21d為宜;小腦以20-21d小鼠胚胎,所獲蒲氏細胞成活率高,顆粒細胞正在分化;脊髓與DRG聯(lián)合培養(yǎng),常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎,取材易,神經(jīng)成活率高。
            (二) 取材。腦則取出相應(yīng)組織,在解剖液中先剪碎,以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上,用小刀將其要成背腹兩側(cè),分別培養(yǎng)。
            (三) 細胞分離與接種。神經(jīng)組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min,移入接種液,停止消化,并洗去胰蛋白酶液,用細口吸管吹打細胞懸液,使其充分分散,如此多次,待沉淀后吸出上層細胞懸液,計數(shù),預(yù)置細胞密度,接種于培養(yǎng)皿(1×106),做電生理應(yīng)為5×105或更低。
            (四) 抑制膠質(zhì)細胞生長。培養(yǎng)3-5d后,也有人認(rèn)為培養(yǎng)7d后,用阿糖胞苷,或5-FU抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的生長。
            (五) 觀察。接種6-12h,開始貼壁,并有集合現(xiàn)象,細胞生長突起明顯,5-7d膠質(zhì)細胞增生明顯,7-10d膠質(zhì)細胞成片于神經(jīng)細胞系下面,形成地毯,2周時神經(jīng)細胞生長zui豐滿,四周暈光明顯,一個月后,有些神經(jīng)細胞開始退化,變形,甚至出現(xiàn)空泡,一般培養(yǎng)2-4周zui宜。
            但神經(jīng)細胞只能增大,而不能增殖,只能原代,不能傳代,不會有細胞周期,而且隨培養(yǎng)時間的延長,細胞數(shù)量在下降,但膠質(zhì)細胞可以,神經(jīng)膠質(zhì)細胞也可以。在培養(yǎng)過程中,早期9-12d時,有較多的神經(jīng)細胞死亡,這是*次死亡階段,應(yīng)注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細胞一般突起長而多,且相互形成突觸。
            (六) 常用培養(yǎng)細胞實驗有:FCM的蛋白總量分析;膜片鉗與離子通道的分析;免疫組化分析;
            但免疫組化分析應(yīng)注意,由于抗體直接作用于活細胞,不易穿透活細胞,故對核內(nèi)抗原定位時,首先考慮膜對抗體的通透性問題。常用化學(xué)試劑以增加其通透性或采用冰凍方法解決。
            在免疫組化中,或其它組織學(xué)染色中,常用不同的染色方法以區(qū)分不同細胞,如半乳糖腦苷脂對小樹突膠質(zhì)細胞標(biāo)記明顯;GFAP對星形膠質(zhì)細胞具有特異性染色等。這對研究神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細胞功能具有極大的應(yīng)用價值。神經(jīng)膠質(zhì)細胞以往多被忽視,其在腦血管疾?。ㄈ缛毖該p傷)、退行性疾?。ㄈ鏏D、PD)、損傷后膠質(zhì)細胞的填充等具有不可忽視的作用。它也是神經(jīng)細胞系功能和營養(yǎng)支持的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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