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            原代細胞轉(zhuǎn)染實驗步驟

            時間:2017/12/14閱讀:2352
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            原代細胞實驗需要注意以下幾點:

            1、DNA的量:Lipofectamine 2000=1:2~3

            2、細胞密度大約占培養(yǎng)板的80%左右,轉(zhuǎn)染。

            3、轉(zhuǎn)染期間不要加抗生素,否則會導(dǎo)致細胞死亡。

            步驟如下:以24孔培養(yǎng)板為例

            1、轉(zhuǎn)染前一天細胞換新的培養(yǎng)基

            2、制備DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物,如下:

            a、用50ul無血清培養(yǎng)基稀釋DNA(0.8g),輕輕混勻;

            b、Lipofectamine 2000使用前,輕輕混勻,用48ul無血清培養(yǎng)基稀釋2ul Lipofectamine 2000,輕輕混勻,室溫孵育5分鐘;

            c、將a+b的液體加在一起,輕輕混勻,室溫孵育20分鐘,使DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物形成;

            3、將100ul DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物加入培養(yǎng)板中,輕輕前后搖勻;

            4、放入37度孵箱中培養(yǎng)24~48h后,1:10傳代,加入G418篩選。加入G418的量設(shè)幾個梯度或者轉(zhuǎn)染前做MTT,找好G418對你所轉(zhuǎn)細胞致死量的濃度。

            5、等細胞在G418作用下,長滿后凍存幾支(保種)。再克隆化培養(yǎng):將細胞消化后計數(shù)50個細胞,加入22ml*培養(yǎng)基中,混勻,分裝在96孔板中(200ul/孔)。第二天在顯微鏡下,尋找孔中有單個細胞的孔并做標記,等做標記的孔長滿后,消化、轉(zhuǎn)移到4孔或6孔培養(yǎng)板中,zui后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),凍存,鑒定。

            6、原代細胞鑒定成功后,建議馬上做后續(xù)實驗,因為在培養(yǎng)過程或凍存中,轉(zhuǎn)進去的基因容易從細胞中掉下來。
            HPLC法含量測定    100mg    100784-200701    美他多辛
            HPLC法有關(guān)物質(zhì)檢查    50mg    100785-200701    D-焦谷氨酸
            檢查用    50mg    100786-200501    托拉塞米雜質(zhì)
            含量測定用    50mg    100787-200501    奈達鉑
            檢查用    100mg    100788-200501    3-吲哚甲酸
            檢查用    100mg    100788-200501    鹽酸托烷司瓊雜質(zhì)
            HPLC法含量測定    100mg    100789-200501    塞曲司特
            HPLC法含量測定    100mg    100790-200501    氫溴酸西酞普蘭
            HPLC法含量測定    100mg    100791-200501    利拉萘酯
            原代細胞

             

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