細(xì)胞如何做好轉(zhuǎn)染實驗及提高實驗效率

① 從健康細(xì)胞開始

Ⅰ 轉(zhuǎn)染實驗前，細(xì)胞解凍后傳代3–4次。 這使得細(xì)胞從解凍過程中恢復(fù)過來，并恢復(fù)正常的生長速度。

Ⅱ 僅使用活性 >90%的細(xì)胞——使用臺盼藍染色可輕松測定細(xì)胞活性。

Ⅲ 定期傳代細(xì)胞，切勿讓細(xì)胞長到匯合狀態(tài)或過度生長。如果讓細(xì)胞長到匯合狀態(tài)，可能會改變細(xì)胞的生長速度以及形態(tài)。a. 請在匯合率達到90%之前對細(xì)胞進行傳代。我們建議您使用胰酶替代物Cellstripper™試劑(Corning 25-056-CI)使細(xì)胞脫壁。Cellstripper™試劑可于室溫下存儲在通風(fēng)櫥中。可通過添加過量的Cellstripper™來跳過PBS洗滌的步驟，然后吸棄全部液體，僅留可覆蓋瓶子表面的液體。

b. 傳代條件取決于所用的細(xì)胞系。 部分經(jīng)驗法則：

對于快速生長的細(xì)胞，倍增時間為16小時(如HEK-293)，按1：10的比例分瓶。

對于生長緩慢的細(xì)胞，倍增時間為36小時(如原代細(xì)胞)，按1：5的比例分瓶。

Ⅳ 保留凍存的細(xì)胞系，并定期解凍新細(xì)胞。 傳代次數(shù)高(>30–40)時，細(xì)胞的生長速度和形態(tài)會改變。

② 進行實驗之前，請先規(guī)劃您的實驗。

務(wù)必要熟悉實驗方案、確定所需的材料量，并在開始實驗前確認(rèn)所需的一切物品條件均已齊備。

Ⅰ 開始前，設(shè)計好鋪板路線圖，標(biāo)注好每次處理或?qū)嶒灄l件。

Ⅱ 計算所需脂質(zhì)體和DNA的儲備量，并確認(rèn)有足夠的下列材料：TransfectGRO減血清培養(yǎng)基(Corning 40-300-CVR)，Lipofectamine® 2000 或Lipofectamine® LTX試劑，以及DNA (0.5–1 µg/µL)。

③ 轉(zhuǎn)染時，請使用DNA。

Ⅰ 使用無內(nèi)毒素的試劑盒和實驗方案制備DNA。

Ⅱ 通過測量OD 260/280值來確定DNA純度，測得的OD值應(yīng)介于1.7–1.9]之間。數(shù)值過高或過低均說明有雜質(zhì)，不宜用于轉(zhuǎn)染實驗。

Ⅲ 在無DNA/RNA酶的水或TE中稀釋DNA。

Ⅳ 制備的工作濃度為0.5–1 µg/µL。 可用SpeedVac®濃縮儀或透析過濾裝置(例如，Millipore Amicon®超濾管)來濃縮DNA。

④ 轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將細(xì)胞鋪板。

Ⅰ 如果在轉(zhuǎn)染前一天或更早時間鋪板，轉(zhuǎn)染效率可能下降。

Ⅱ 轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞密度保持在匯合率為70–90%。

Ⅲ 轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞密度影響轉(zhuǎn)染效率。 為了簡化轉(zhuǎn)染優(yōu)化過程或節(jié)省時間，我們建議細(xì)胞鋪成2種不同的密度，以確保較高的轉(zhuǎn)染效率。

Ⅳ 細(xì)胞的鋪板和轉(zhuǎn)染可同時進行，或者通過反向轉(zhuǎn)染操作進行。 反向轉(zhuǎn)染操作中，使用的細(xì)胞是正常/正向轉(zhuǎn)染的2.5倍以上。

Ⅴ 轉(zhuǎn)染復(fù)合物可以加到含抗生素和血清的培養(yǎng)基中，且不會影響轉(zhuǎn)染效率。