研究了很久的原代細胞培養(yǎng)，如何能夠使細胞形態(tài)更好、養(yǎng)的更漂亮，在此把一些經驗和體會總結分享給大家！
不同的細胞，對培養(yǎng)環(huán)境的要求不一樣
這個不僅僅是說培養(yǎng)基的不同，還有就是細胞生長的空間密度問題。有一些細胞是數量多一點比較好生長，生長狀態(tài)也比較好。這種一般是屬于生長速度慢的細胞。譬如內皮細胞。而有一些是細胞是數量少一點細胞狀態(tài)會生長的比較好，譬如巨噬細胞和某些腫瘤細胞。
尤其是巨噬細胞，生長速度非常得快，貼壁速度很快，所以傳代時就應該留很少量的細胞，這樣細胞狀態(tài)會比較好。并且巨噬細胞比較喜歡扎堆生長，而堆與堆之間是有空間的。如果長成相連在一起的一滿片的時候，細胞形態(tài)基本上就會差了，老化的會比較多，對后期實驗結果是不好的。
所以在養(yǎng)細胞的時候應該摸索該細胞喜歡的生長空間密度。
養(yǎng)的細胞形態(tài)怎么都不好？
對于貼壁細胞，如果細胞形態(tài)不好，或者細胞形態(tài)不清晰，表面似有異物等，可以在傳代的時候進行如下操作：
      首先，倒掉舊的培養(yǎng)基，加入 3 mL 新的培養(yǎng)基（有無血清的都可）洗滌一次，用滴管吸走。然后再加入 3 mL 的培養(yǎng)基，進行預吹打，控制吹打力度，輕輕地大概沿著瓶底過一遍，然后吸走。這時侯再開始正式的消化、吹打。
注：巨噬細胞我們只吹打，不消化的。
其次，把吹打下來的細胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶內，培養(yǎng)瓶事先加入培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，按時間點觀察細胞貼壁情況。10 分鐘觀察一次，20 分鐘，30 分鐘觀察一次。選擇一個時間點，已經有部分細胞貼壁的情況下，重新置于潔凈臺，底面朝上迅速倒出其中的培養(yǎng)基，加入 3 mL 新培養(yǎng)基再輕輕洗一次。然后加入*培養(yǎng)基培養(yǎng)。后續(xù)觀察細胞生長情況以及形態(tài)。這就是二傳。
如果一次效果還不理想，可重復多次。直到找到細胞形態(tài)。其中要注意結合細胞喜歡的生長情況。喜歡多一點數量長得好的細胞你就等貼壁細胞比較多點的時候再傳。反之亦然。這個方法真的很好用。
培養(yǎng)基的量的問題
這個是要靠自己去摸索你所養(yǎng)的細胞的。并不是小的玻璃方瓶 12 mL，大方瓶14mL 的。有些細胞反而是培養(yǎng)基少一點相反細胞形態(tài)會長得比較好。對于生長速度快的細胞，易生長的細胞加少一點培養(yǎng)基細胞形態(tài)會更好。但是要注意換液掌握。
培養(yǎng)瓶選擇的問題
個人發(fā)現生長速度快的細胞在玻璃瓶內生長的狀態(tài)會比一次性塑料瓶相對好一些。而對于同一種細胞，在其生長旺盛快速的時期在玻璃瓶內的生長狀態(tài)也比塑料瓶內好。這可能是因為塑料瓶比玻璃瓶更容易貼壁。生長速度快的細胞在塑料瓶這種相對更安逸的環(huán)境里反而長得狀態(tài)不如玻璃瓶好。
所以對于生長速度慢的細胞如果想要更漂亮的細胞狀態(tài)，塑料瓶比玻璃瓶會好，對于生長速度慢的細胞，玻璃瓶則會更好。同樣，對于同一種細胞，在其生長速度慢的時候，塑料瓶會好一點，比如剛剛復蘇的時候，或者原代培養(yǎng)的時候。而在其生長旺盛的時候，玻璃瓶則相對會好一點。
傳代時消化的問題
      可以這樣說，對于需要消化傳代的細胞，每一次的消化都是對這個細胞存活與否，狀態(tài)好與不好zui至關重要的考驗。
很多同學都遇到過這個問題，自己養(yǎng)的細胞開始的幾代長的還挺好的，可是穿過幾代之后就發(fā)現自己的細胞不行了，狀態(tài)越來越差勁了。對于這個問題，可以非?？隙ǖ卣f，你的消化環(huán)節(jié)出問題了。你每一次的消化都讓細胞受到較大損傷了。所以，越長越差。
      在消化的過程中，你加入胰酶后，所有細胞都在被胰酶消化著，但是我們忽視了一個問題就是，細胞的生長狀態(tài)是不一樣的，每一個原代細胞的貼壁情況也是不一樣的，有的貼壁牢固，有的貼壁沒有那么牢固的，所以，讓所有的細胞消化同樣的時間對細胞是不公平的，他們受到了差別待遇當然會有脾氣啊。我后來對消化的方法進行了改良，我稱之為四步消化法，以難消化細胞為例，具體操作如下：
1.首先不加胰酶，倒掉舊培養(yǎng)基加入少量新培養(yǎng)基洗 1-2 遍。這是前奏，即為*步，目的是將漂浮著的死細胞之類盡量洗掉。
2.然后再加入少量新培養(yǎng)基直接吹打一遍，這一遍是把貼壁不牢固的細胞吹打下來。再用培養(yǎng)基洗一遍，兩次所得懸液混合傳入新瓶，即為第二步。你可以將這些傳入新瓶培養(yǎng)，以與后面胰酶消化過的細胞對比觀察看誰長的更好一點就知道該細胞對胰酶的敏感度了。
3.吸干凈瓶內剩余液體，加入 0.3 mL 左右的胰酶潤洗一遍，吸掉棄之，再加入 1 mL 左右的胰酶消化。消化的同時置于顯微鏡下觀察，待細胞與細胞之間間隙明顯的時候立即吸掉胰酶與干凈子彈頭里備用，加入新培養(yǎng)基開始吹打，吹打 2-3 遍后吸取懸液于試管或新瓶暫存。用 2 mL 左右新培養(yǎng)基洗一遍與前面的混合。你也可以傳入新瓶培養(yǎng)，以與后面及前面的做對比。這是第三步。
4.然后把前面剛吸出來的胰酶重新加進去瓶里繼續(xù)消化剩余的貼壁牢固的細胞。當然你也可以用新的胰酶，如果你們那比較富裕的話。繼續(xù)鏡下觀察，待剩余細胞間隙明顯，細胞獨立開來的時候，吸掉胰酶，加入新培養(yǎng)基吹打。懸液傳入新瓶培養(yǎng)，以實際情況你自己把握。
其實還可以有第五步，對于特別難消化的細胞和對胰酶特別敏感的細胞的話，你可以繼續(xù)加第五步甚至第六步。為了細胞更好的狀態(tài)，更漂亮的樣子，沒辦法，你必須分多批多次消化，這樣才能zui大限度地將胰酶對細胞的損傷降到zui低，保證細胞的狀態(tài)能夠*。
當然了，如果細胞是屬于那種很容易消化的細胞，像 RAW264.7，僅僅第二步就搞定了。就沒必要第三步第四步了。這個是需要你在實驗中能夠自己用心去體會的。建議你接手一個新細胞時把各步消化的細胞分別培養(yǎng)起來做比較，去摸索好細胞對胰酶的要求，便于你后續(xù)實驗的開展。
將細胞消化分成這幾步，除了是為了避免胰酶對細胞的損傷之外，還有一個更重要的作用就是，可以zui大程度地把細胞吹打成單個單個的狀態(tài)，不成片不連體。
因為細胞生長的時候肯定是要相互，大部分的細胞都是要成片生長的，尤其是對于貼壁細胞，單個細胞貼壁之后長著長著就長到一片去了。但是如果是成片的細胞抱團的話，傳代后細胞是不能貼壁的，這樣抱團的細胞就會死亡。所以，消化傳代的時候一定要將細胞消化成單個單個的獨立狀態(tài)，這個是非?？季磕愕墓Ψ虻?。
細胞一旦脫落入懸液里你很難再將他吹打成單個，因為他沒有受力點了。很難找到受力點讓你對他吹打的力分散開細胞。所以必須要在細胞未脫落之前將其吹打開，受力點就是細胞貼壁的地方。這樣你就必須要嚴格控制好消化的程度，這和大師做飯掌握好火候是一樣的道理。
既要消化到容易吹打下來，又不能太過，一吹就整片脫落，要單個單個地往下掉。所以我才要分批分次地加胰酶消化就是為了保證不同生長狀態(tài)貼壁程度的細胞能夠都維持在好的受力點分散開。這個是很重要的一點。尤其是對于某些細胞這一點就是他活或死的致命點，像 Caco-2 細胞就是如此。
另外關于傳代很重要一點就是一定不能等到細胞長滿的時候才去消化傳代。要在細胞長到 70% 左右的時候就要傳代了，一旦發(fā)現細胞生長中已經有疊層生長的時候就要立即進行消化傳代，不能再拖。
換液傳代時候洗瓶的問題
對于用 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞，你在洗的時候如果是用無血清 1640 去洗細胞在隨即后的幾次中會比用 DMEM 洗的長的要好。同樣，用 1640 培養(yǎng)的也有這個現象。
如果不嫌麻煩的話，可以用 PBS 來洗，洗的效果和用無血清培養(yǎng)基洗的效果基本上是一樣的，對于有些細胞會更勝*。洗的目的主要是洗去培養(yǎng)瓶里殘留的血清，防止它對胰酶的影響。這樣能夠保證胰酶的消化能力優(yōu)先，是很關鍵的一點。
使用 PBS 洗是很重要的一步，zui近發(fā)現，用 PBS 就可以把細胞消化開來。加入 PBS 放置 10 ~ 15 分鐘，有些需要更長的時間，等到細胞一個個分離開來的時候，就可以直接吹打下來，但是和胰酶消化一樣，要控制好時間，不能時間太過了，要不然損傷細胞，細胞不容易成活，狀態(tài)容易不好。這個方法對于某些細胞是很管用的。有些原代細胞用胰酶消化不容易消化成單個的時候，或者臨時沒有胰酶了，可以選用此方法。不過一定要試試，看是否適合你的細胞。