1.細(xì)胞系將處理好的蓋玻片放在12孔板底部

如果細(xì)胞貼壁不牢（如HEK293）或者是半貼壁細(xì)胞（如 PC12），可以用細(xì)胞刮子將鼠尾膠原均勻地涂抹在玻片上包被。也可使用多聚賴氨酸，但是效果不如鼠尾膠原。事實(shí)上大部分貼壁的細(xì)胞都不用進(jìn)行包被。如果在操作中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞脫片嚴(yán)重，則可考慮進(jìn)行包被來(lái)提高細(xì)胞貼壁能力。

2.將與培養(yǎng)基混勻后的細(xì)胞懸液加入孔中

這一步混勻非常重要，如果不勻，一般細(xì)胞都會(huì)聚集在玻片中央?yún)^(qū)域，會(huì)對(duì)形態(tài)觀察產(chǎn)生不利影響。分細(xì)胞的時(shí)候要注意進(jìn)行形態(tài)觀察的時(shí)候應(yīng)該將細(xì)胞分得相對(duì)稀一些，密集的細(xì)胞不利于形態(tài)觀察。每孔細(xì)胞的數(shù)量根據(jù)細(xì)胞大小的不同應(yīng)該作出相應(yīng)調(diào)整，一般104個(gè)細(xì)胞即可。

3.待24h后，細(xì)胞貼壁，即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染

初次試驗(yàn)建議轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的表達(dá)質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照來(lái)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率和染色操作，并且要分別設(shè)單轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染孔來(lái)方便一種蛋白影響另一種蛋白表達(dá)時(shí)的結(jié)果分析，所以轉(zhuǎn)染的時(shí)候一共要設(shè)以下孔：①ProteinA-V5；②ProteinB-MYC；③ProteinA-V5+ProteinB-MYC；④Positive-V5；⑤Positive-MYC。

因?yàn)榧?xì)胞分得較稀，所以對(duì)于轉(zhuǎn)染試劑的毒性也會(huì)更加敏感，所以有時(shí)候有必要將轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒減量。

4.轉(zhuǎn)染完成大于24--48h后，固定用PBS將細(xì)胞洗3遍，每遍 5min，如果細(xì)胞貼壁不牢（如HEK293）或者是半貼壁細(xì)胞（如 PC12），應(yīng)該將12孔板傾斜，將PBS從低處緩緩加入，再平放，以免使細(xì)胞脫片。然后加入4%多聚甲醛固定液（如果細(xì)胞貼壁不牢，必須以同樣的輕柔方式），室溫固定10--15min，如果細(xì)胞貼壁不牢（如HEK293PC12），應(yīng)該將12孔板傾斜，從低處緩緩加入，再平放，以免使細(xì)胞脫片。過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的固定會(huì)影響蛋白的免疫原性，對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)10--15min的固定已經(jīng)足夠。

5.用PBS將細(xì)胞洗3遍，每遍5min

方法同前

6.細(xì)胞透化

室溫下，0.5% TritonX10/PBS透化處理10min。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或者強(qiáng)度過(guò)高的透化有可能會(huì)破壞細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)我們提供的透化已經(jīng)足夠用于全細(xì)胞染色。

7.用4℃預(yù)冷的PBS將細(xì)胞洗3遍，每遍5min

8.封閉

以3% BSA/PBS封閉，37℃，30min或4℃ 過(guò)夜。這里我們推薦37℃，30min。此步主要用于封閉非特異蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。也可以使用正常的鼠、兔、羊等與抗體相對(duì)應(yīng)的正常血清作為封閉劑，使用的時(shí)候要進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尅?/p>

9.PBS將細(xì)胞洗一遍

方法同前。如細(xì)胞易脫落也可以不洗。

10.一抗孵育

在每孔中加入50μl以PBS按一定的稀釋度稀釋的一抗。（一般參考抗體說(shuō)明書(shū)上推薦的濃度，例如Invitrogen公司的V5抗體，我們使用1∶10耀1∶20的稀釋度；如果進(jìn)行雙免疫熒光分析則可以同時(shí)加入兩種一抗。）在蓋玻片上蓋一層封口膜（15ml離心管在封口膜上扣下的印跡可以作為裁剪封口膜的邊界），于濕盒中，37℃，30min或者4℃過(guò)夜。4℃過(guò)夜的一抗孵育有利于抗體和抗原蛋白充分結(jié)合，這里推薦大家使用4℃過(guò)夜作為一抗孵育的實(shí)驗(yàn)條件。

當(dāng)然也可以使用多加抗體稀釋液的方法，但是這樣比較浪費(fèi)抗體。事實(shí)上4℃過(guò)夜孵育用過(guò)的抗體還可以被回收使用，這種方法在商品化抗體價(jià)格高昂的情況下還是有一定實(shí)用價(jià)值的，不過(guò)關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)中不推薦。

11.用4℃預(yù)冷的PBS將細(xì)胞洗3遍，每遍5min，洗去多余的一抗

方法同前

12.二抗孵育

在孔中加入50μl以PBS按1∶50稀釋的熒光素標(biāo)記的二抗（選用中杉抗體作為參考，如果進(jìn)行雙免疫熒光分析則同時(shí)加入兩種二抗），在蓋玻片上蓋一層封口膜，濕盒中，37℃，30min（推薦）或者4℃過(guò)夜。一般來(lái)說(shuō)二抗還可以稀釋以取得更加特異的染色效果。

13.用4℃預(yù)冷的PBS將細(xì)胞洗3遍，每遍5min方法同前

14.雙蒸水將細(xì)胞洗3遍，每遍5min

15.如果需要染核，在細(xì)胞上滴加DAPI工作液，如果不需要，可直接進(jìn)行乙醇漂洗如果細(xì)胞貼壁不牢（如HEK293PC12），應(yīng)該將12孔板傾斜，從低處緩緩加入，再平放，以免使細(xì)胞脫片。

16.甲醇漂洗

17.乙醇漂洗

18.用針頭將在乙醇中的玻片撬起一側(cè)，用鑷子將玻片取出放在濾紙上晾干

19.封片：取8μl封片劑滴在載玻片上，將蓋玻片有細(xì)胞的一面朝下封片。封片劑不能多加，否則玻片會(huì)滑動(dòng)

20.待封片劑均勻分布于蓋玻片下，即可周圍用指甲油封住（指甲油也只能加適量）為了取得*的染色效果，有時(shí)候有必要將一抗、二抗進(jìn)行梯度稀釋，再進(jìn)行組合用來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色。例如，一抗：1∶50，1∶10，1∶20，1∶40；二抗：1∶10，1∶20通過(guò)這樣的方法得到的染色片在倒置熒光顯微鏡下信號(hào)清晰明亮、本底低、對(duì)比明顯，才能滿足激光共聚焦顯微鏡觀察的要求。因?yàn)榧す夤簿劢癸@微鏡逐點(diǎn)掃描特定焦平面各點(diǎn)，所以在目鏡下弱的信號(hào)一般都很難被采集到。

另外細(xì)胞系需要注意的一點(diǎn)，在實(shí)際操作中和文獻(xiàn)報(bào)道中我們發(fā)現(xiàn)有可能兩種蛋白不能一起過(guò)表達(dá)，即共轉(zhuǎn)染的時(shí)候只能得到一種蛋白的過(guò)表達(dá)產(chǎn)物，這樣的情況下就無(wú)法使用這種方法。
53016-31-2     去乙酰基諾孕酯標(biāo)準(zhǔn)品    Deacetylnorgestimate    25mg
5297-17-6     氯琥珀酰單膽堿標(biāo)準(zhǔn)品    Succinylmonocholine Chloride    150mg
529-59-9     染料木苷標(biāo)準(zhǔn)品    Genistin    30mg
52-86-8     氟哌啶醇標(biāo)準(zhǔn)品    Haloperidol     200mg
528-58-5    氯化花青素標(biāo)準(zhǔn)品    Cyanidin Chloride    25mg
527-75-3    紅霉素B標(biāo)準(zhǔn)品    Erythromycin B    100mg
52-76-6     利奈孕醇標(biāo)準(zhǔn)品    Lynestrenol    20mg
5270-74-6    氯噻酮相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品        10mg
52699-48-6     醋酸戈那瑞林標(biāo)準(zhǔn)品    Gonadorelin Acetate    50mg
細(xì)胞系