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細(xì)胞培養(yǎng)是一種無菌技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物和不受其他有害因素的影響。為防止微生物污染和有害因素的影響，細(xì)胞培養(yǎng)室要求環(huán)境清潔，空氣清新、干燥、無塵。

細(xì)胞培養(yǎng)實驗室由無菌操作區(qū)、孵育區(qū)、制備區(qū)、儲藏區(qū)、清洗和消毒滅菌區(qū)6部分組成，這些區(qū)域的共同特點是房間要寬敞、明亮，地面要便于清潔、防滑，墻壁的質(zhì)地光滑堅硬，儀器設(shè)備布局合理，方便操作，避免交叉干擾，陳設(shè)簡潔，便于清掃。

一、無菌操作區(qū)

無菌操作區(qū)是只限于細(xì)胞培養(yǎng)及其他無菌操作的區(qū)域，最好能與外界隔離，不能穿行或受其他干擾。在一般環(huán)境的空氣中，由于存在許多塵埃和雜菌，較易造成污染。

因此，接種工作要在空氣經(jīng)過滅菌的環(huán)境里進行，小規(guī)模的無菌環(huán)境可利用超凈工作臺創(chuàng)造，大規(guī)模的需建無菌室。

理想的無菌操作室應(yīng)劃為三部分：

1. 更衣室―供更換衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。

2.緩沖間―位于更衣間與操作間之間，用于準(zhǔn)備工作，還有防止污染的作用，以保證操作間的無菌環(huán)境，同時可放置恒溫培養(yǎng)箱以及必需的小型儀器。

3.無菌操作間―無菌操作間則專用于無菌操作、細(xì)胞培養(yǎng)，其大小要適當(dāng)，且其頂部不宜過高以保證紫外線的滅菌效果；墻壁光滑*以便清洗和消毒，無菌操作間容積小且為密閉式，一般無菌操作間的空氣消毒用紫外線燈，有的實驗室使用無臭氧紫外線消毒器或電子消毒滅菌器。

凈化工作臺：操作簡單，安裝方便，占用空間小且凈化效果很好。一般細(xì)菌培養(yǎng)室使用的凈化工作臺主要有兩種：

（1）側(cè)流式或稱垂直式。

（2）外流式或稱水平層流式。

二、孵育區(qū)

孵育區(qū)也稱培養(yǎng)區(qū)，本區(qū)對無菌的要求雖不比無菌區(qū)嚴(yán)格，但仍需清潔無塵，因此也應(yīng)設(shè)置在干擾少而非來往穿行的區(qū)域。孵育可在孵箱或可控制溫度的溫室中進行，后者費用高，一般實驗室多采用孵箱進行工作。

三、制備區(qū)

制備區(qū)主要進行培養(yǎng)液及有關(guān)培養(yǎng)用的液體等的制備。應(yīng)設(shè)有試劑柜、器械柜、實驗臺和上水道、電源等，配備的主要儀器設(shè)備有水純化裝置、天平、微波爐、pH計、抽氣泵、電爐、培養(yǎng)分裝器、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管、燒杯、量筒、容量瓶等。

在有天平、pH計、磁力拌器等設(shè)備下完成制備以后，應(yīng)在無菌操作臺進行過濾除菌。液體制備直接關(guān)系組織細(xì)胞養(yǎng)的成敗，因此必須嚴(yán)格無菌操作。

四、儲藏區(qū)

儲藏區(qū)主要存放各類冰箱、干燥箱、液氮罐、無菌培養(yǎng)液、培養(yǎng)瓶等，此環(huán)境也需要清潔無塵。為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般為液氮溫度-196℃。

細(xì)胞的凍存過程需要一系列程序降溫，一般為4 ℃下存放30min。轉(zhuǎn)放-20 ℃ 1 h，再轉(zhuǎn)入-80—-70℃過夜，之后才可以轉(zhuǎn)移到液氮內(nèi)(-196℃)。因此儲存區(qū)必須配備冰箱、低溫冰箱、超低溫冰箱和液氮罐等設(shè)備。

五、清洗和消毒滅菌區(qū)

清潔和消毒滅菌區(qū)應(yīng)與其他區(qū)域分開，主要進行所有細(xì)胞培養(yǎng)器皿的清洗、準(zhǔn)備、消毒及三蒸水制備等工作，應(yīng)備有高壓蒸汽滅菌鍋、細(xì)菌過濾設(shè)備、電熱干燥箱、消毒柜、排風(fēng)設(shè)備等。

六、細(xì)胞實驗室的建設(shè)要求

1.環(huán)境要求

溫度：儀器還是操作對溫度沒有特殊要求，維持舒適的溫度即可，比如18~26度。

濕度：過高的濕度會導(dǎo)致微生物的滋生，所以建議正常維持濕度在70%以下。

潔凈度：細(xì)胞實驗對潔凈區(qū)并沒有要求，細(xì)胞實驗里面只有細(xì)胞操作的時候要求無菌的環(huán)境，這時要求有局部的百級，通?？梢岳贸瑑襞_或者生物安全柜來實現(xiàn)，不過有時候為了有個更好一點的環(huán)境，減小超凈臺過濾器更換的時間，會維持室內(nèi)的潔凈度，比如萬級的潔凈度。

無菌無毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細(xì)胞在體外培養(yǎng)成功的首要條件。細(xì)胞培養(yǎng)對無菌環(huán)境要求很高，在細(xì)胞操作時，一般需要在100級空氣質(zhì)量條件下進行。

在體外培養(yǎng)的細(xì)胞由于缺乏對微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染，或者自身代謝物質(zhì)積累，可導(dǎo)致細(xì)胞中毒死亡。

照明：滿足實驗用的操作照度，通常在300LUX。

2.圍護結(jié)構(gòu)要求

雖然實驗的操作對大環(huán)境沒有特殊要求，不過最好能有不產(chǎn)塵、不積塵的環(huán)境，能保證室內(nèi)的清潔，并且易于清洗、不容易滋生微生物，所以在選擇維護結(jié)構(gòu)時，選用彩鋼板、醫(yī)療板等潔凈板材是比較好的選擇，為了保證室內(nèi)的通透性，可以布置密閉窗。

3.消毒

通常做完實驗后，都需要做終末消毒，室內(nèi)需要安裝紫外燈，利用紫外燈對空氣和表面消毒。

德國MB生產(chǎn)的Mycoplasma-offTM噴霧劑，或濕巾擦拭 5-10分鐘清除，對支原體、細(xì)菌、真菌、霉菌、孢子祛除確切有效。無殘留, 無腐蝕, 無致癌性，操作簡單方便。

qPCR法介紹：

熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記，使PCR擴增后的產(chǎn)物帶有熒光，利用熒光信號的變化和配套軟件，進行DNA擴增反應(yīng)的實時監(jiān)測，簡稱qPCR。

優(yōu)點：①靈敏度高、特異性強。

②時間短，2-3小時出結(jié)果。

③檢測結(jié)果可定量。

④操作簡便。

缺點：①對于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結(jié)果會出現(xiàn)假陽性。（可用培養(yǎng)法做補充驗證）

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大（由于引物及內(nèi)在設(shè)計不同），需謹(jǐn)慎選擇，盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。