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一般細(xì)胞遇到支原體污染時(shí)，應(yīng)立即丟棄，以避免成為污染源。但對(duì)于非常珍貴的細(xì)胞、不易獲得的生物樣本或細(xì)胞種子，遇到支原體污染，希望挽救而不能丟棄時(shí)，應(yīng)怎么辦呢？

這里向您推薦支原體*清除法——使用德國MB公司生產(chǎn)的Mynox® Gold，直接殺除支原體并在細(xì)胞培養(yǎng)三代過程中鞏固防護(hù)，即可*清除細(xì)胞中的支原體。

支原體污染祛除劑——Mynox® Gold（細(xì)胞保種用）

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產(chǎn)品信息

（生產(chǎn)商：德國MB公司）

每套Mynox® Gold支原體祛除劑

包括：

1管 首ci治療液Mynox®

3管 鞏固防護(hù)液

推薦使用范圍：研究用

2

產(chǎn)品特點(diǎn)：　

1.支原體祛除有效率接近100%。

2. 適合所有細(xì)胞類型， 包括永生細(xì)胞（如Vero, BHK21, GBK, ML, Hep2, CRFK, H9, Molt4, MT-4, Jurkat）、原代細(xì)胞和干細(xì)胞。

3. 無細(xì)胞毒性。用Mynox® Gold處理細(xì)胞時(shí)，大多數(shù)類型細(xì)胞沒有形態(tài)變化。

4. 低耐藥風(fēng)險(xiǎn)。主要采用生物物理學(xué)方法直接清除支原體。

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工作原理

【首ci治療液Mynox®】是一款直接殺除支原體的試劑。

它來自枯草桿菌提取物，可特異性地與支原體膜結(jié)合，改變支原體膜通透性，從而使支原體在2-3小時(shí)內(nèi)破潰死亡（下圖）。

【鞏固防護(hù)液】加入培養(yǎng)基，后續(xù)培養(yǎng)一個(gè)月，將會(huì)*清除細(xì)胞中的支原體污染，確切有效（3管「鞏固防護(hù)液」可傳3代）。

4

使用方法

實(shí)驗(yàn)所需耗材：25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60 mm 培養(yǎng)皿

支原體消除結(jié)果評(píng)估：采用支原體檢測試劑盒如Venor®GeM系列。

具體操作步驟如下（超凈臺(tái)內(nèi)操作）：

01

制備“首ci治療混合液"

1）吸量管吸取4.5ml含5%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，加入到無菌的15ml離心管中。再加入500 µl Mynox ® Gold首ci治療液（橘黃色蓋）。

2）將15ml離心管內(nèi)的培養(yǎng)基和Mynox® Gold首ci治療液混勻。

3）將15ml離心管內(nèi)的混合液（5ml）轉(zhuǎn)移至無菌的25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60 mm 培養(yǎng)皿中。

02

加入細(xì)胞

按細(xì)胞正常傳代來操作。對(duì)于貼壁細(xì)胞，使用胰酶將細(xì)胞解離打散。

1）注意：顯微鏡下觀察，確保為單細(xì)胞懸液，無細(xì)胞成團(tuán)。

2）吸量管吸取5ml單細(xì)胞懸液（含104–105細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基含5%胎牛血清），加入到上述的“首ci治療混合液"中。此時(shí)總體積為10ml。

注意：加入細(xì)胞時(shí)，吸頭插入到液面下，以避免產(chǎn)生氣溶膠。吸頭不要觸及培養(yǎng)瓶/皿的內(nèi)壁。

3）輕輕搖晃培養(yǎng)瓶/皿，以避免細(xì)胞分布不均。將細(xì)胞轉(zhuǎn)至孵箱正常培養(yǎng)。

03

主要治療

1）細(xì)胞長至80~90%匯合。

2）細(xì)胞正常傳代。取9.5ml已加新鮮培養(yǎng)基的細(xì)胞，加到無菌培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中。再加入500 µl Mynox® Gold鞏固防護(hù)液（透明管蓋）。調(diào)整胎牛血清濃度，不再將其濃度再保持在5%，可恢復(fù)正常濃度。

3）加入鞏固防護(hù)液的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，再重復(fù)以上步驟2次（采用Mynox® Gold鞏固防護(hù)液治療2次）。第3次鞏固防護(hù)液治療后，支原體即*去除（細(xì)胞總共傳了4代）

04

支原體殘留的檢測

支原體被Mynox®裂解后會(huì)釋放DNA到培養(yǎng)基中，此時(shí)檢測支原體會(huì)導(dǎo)致假陽性。應(yīng)在正常培養(yǎng)四代后檢測支原體。培養(yǎng)基更換和使用外源DNA酶可在1-2代內(nèi)降低游離的支原體DNA。

建議采用高靈敏度的Venor® GeM支原體檢測試劑盒檢查支原體。

注意：

a) 做支原體清除時(shí)，一次治療的細(xì)胞數(shù)不要超過105。

b) Mynox® Gold的支原體殺除活性受到反應(yīng)混合液中的脂質(zhì)和蛋白濃度的影響。在步驟1和步驟3中，與「首ci治療液」配合使用的培養(yǎng)基，F(xiàn)BS濃度均為5%，不要濃度過高。從步驟5開始，與「鞏固防護(hù)液」配合使用的培養(yǎng)基，其中FBS的濃度則恢復(fù)為原來正常使用的濃度。

c) Mynox® Gold通過和支原體膜直接接觸而產(chǎn)生殺滅效應(yīng)。應(yīng)避免細(xì)胞成團(tuán)，否則支原體可能躲在細(xì)胞間隙中，影響祛除率