一、產(chǎn)物直接純化
PCR擴(kuò)增完成后需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在條帶單一無其他雜帶的情況下，可以直接對產(chǎn)物進(jìn)行純化，常見的純化方法有：
1、硅膠層析柱法
原理：大多數(shù)離心柱中吸附DNA的是一層硅膠膜，實(shí)際上就是一層玻璃纖維，其表面有大量修飾的硅羥基（Si-OH），硅羥基在溶液中解離后帶負(fù)電，然后與帶正電鹽離子、帶負(fù)電DNA形成電橋，從而吸附住DNA，使得DNA雙鏈變單鏈，不會被生物大分子溶劑洗脫，但能經(jīng)水溶性緩沖液水化后，被定量回收，從而實(shí)現(xiàn)純化分離。
圖1 硅膠層析原理示意圖
圖2 硅膠層析流程簡圖
2、磁珠法（abs60151）
原理：磁珠是有磁性的能吸附DNA的物質(zhì)，其內(nèi)部核心是鐵離子，在磁場作用下可以吸附在磁體上。在核心外，經(jīng)過羧化，帶有羧基基團(tuán)，在特定的離子條件下，可以與DNA結(jié)合。結(jié)合后，在外磁場的作用下，磁珠與DNA結(jié)合體移動到磁體周圍，可以很方便去除其他多余的液體，這時，不能與磁珠結(jié)合的所有雜質(zhì)都隨水溶液一并去除。然后，在洗脫條件下，DNA與磁珠分離，溶解在水中，將溶解有DNA的溶液轉(zhuǎn)移，就得到了純化后的DNA樣本。
圖3 磁珠法結(jié)構(gòu)示意圖
圖4 磁珠法純化DNA流程簡圖
3、其他純化方法
①滲透液結(jié)合醇沉純化
原理：利用分子大小不同，小分子的物質(zhì)能夠通過滲透膜溶解到大量的溶液中去，而大分子的物質(zhì)不能通過滲透膜，所以繼續(xù)留存在透析袋中，通過乙醇沉淀最后達(dá)到去除小分子物質(zhì)，得到純化的有機(jī)大分子的效果。
②直接沉淀純化
原理：DNA分子在高鹽離子醇溶液中會被沉淀出來，而其他物質(zhì)繼續(xù)溶液在溶液中，沉淀出來的DNA分子經(jīng)過離心與溶液成分分開，達(dá)到純化的目的。
不同純化方法對比
純化方法 | 硅膠層析柱法 | 磁珠法 | 滲透液純化 | 沉淀純化 |
純化介質(zhì) | 硅膠膜 | 磁珠 | 滲透膜 | 乙醇/異丙醇 |
優(yōu)勢 | 操作簡便、快速、安全，產(chǎn)物純度高隨時用于下游實(shí)驗(yàn) | 產(chǎn)物純度高；通量高，可實(shí)現(xiàn)自動化；操作簡便、快速、安全；高靈敏度 | 樣本處理體積靈活，產(chǎn)量高，成本低 | |
劣勢 | 存在堵柱風(fēng)險；對樣本起始量有限制；難以實(shí)現(xiàn)自動化操作，大批量處理費(fèi)時費(fèi)力；小于100bp的DNA段難以吸附 | 需要搭配磁力架或者儀器使用，成本較高；部分DNA難以被抓取導(dǎo)致回收率低；小于100bp的DNA段難以吸附 | 安全性低，無法進(jìn)行高通量提取、純度較低 | |
選擇依據(jù) | 樣本起始量較充足，但數(shù)量不多，需要操作簡便省時，且提取出的DNA能用于絕大多數(shù)下游實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室 | 下游需要高純度的DNA，需要大批量處理，能夠支持自動化提取的實(shí)驗(yàn)室 | 時間充足，樣本量充足，想節(jié)省成本的實(shí)驗(yàn)室 | |
二、凝膠回收純化
如電泳檢測結(jié)果存在非特異性條帶，則需要將目的條帶切出來，再用膠回收試劑盒（abs60098）對凝膠進(jìn)行回收純化，相較于直接純化，只是多了一步溶膠的過程，相應(yīng)的產(chǎn)物純度提高，回收率則下降。
結(jié)語：
在PCR擴(kuò)增完成后，反應(yīng)體系中除了DNA段，還存在離子、dNTP、引物及聚合酶等物質(zhì)，這些物質(zhì)會影響后續(xù)克隆測序等實(shí)驗(yàn)，因此對其產(chǎn)物進(jìn)行純化是必*步驟，不同的純化手段各有自己的優(yōu)缺點(diǎn)，老師們可以根據(jù)自己的需求選擇適合自己的方法。
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