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            科學培養(yǎng)指南——類器官
            
        			
            閱讀：2768      發(fā)布時間：2022-11-17
        				
            
							
				
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            類器官簡介

            類器官（Organoids）指利用成體干細胞或多能干細胞進行體外三維（3D）培養(yǎng)而形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的組織類似物。盡管類器官并不是真正意義上的人體器官，但能在結(jié)構(gòu)和功能上模擬真實器官，能夠模擬體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)及功能并能夠長期穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。

            類器官的種類
            類器官的發(fā)展史


            早在 20 世紀 80 年代，“organoid"一詞就已經(jīng)提出, 1907年，美國貝克羅萊那大學教授威爾遜發(fā)現(xiàn)通過機械分離的海綿細胞可以重新聚集并自組織成為新的具有正常功能的海綿有機體，是未來類器官技術(shù)發(fā)展的源頭。威爾遜的研究證明了成年的有機體在無需外界幫助、無需從特定的解剖學階段開始，也具有完整的信息并可以成功發(fā)育成新的有機體。當代類器官的發(fā)展成果，主要集中在近十余年。2009年，Hans Clevers實驗室使用單個鼠LGR5+腸干細胞在體外自組織成為具有腸隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)的腸類器官，開啟了類器官發(fā)展的新篇章。

            目前，多種臟器類器官已被成功構(gòu)建，其中包括小腸、胃、結(jié)腸、肺、膀胱、大腦、肝臟、胰腺、腎臟、卵巢、食道、心臟等，不僅包括正常器官組織類器官，還有相應(yīng)腫瘤組織類器官。近幾年涉及類器官研究的文獻數(shù)量呈直線上升趨勢，其中不乏多篇CNS等各大頂級期刊文獻。中國發(fā)表的類器官文獻數(shù)量在全球的排名從第六位（2009-2019年）躍至第二位（2020年），今次與美國。2021年，類器官被列為“十四五"國家重點研發(fā)計劃重點專項，隨著相關(guān)研究不斷深入，我國類器官技術(shù)水平將進一步提升，同時在相關(guān)企業(yè)積極布局下，類器官市場化程度將不斷提升。


            類器官研究發(fā)展進程
            類器官模型與其他模型比較


            目前主要應(yīng)用臨床藥物篩選的模型主要分為2D細胞模型，3D類器官和人源性動物移植模型（PDX）。其中腫瘤藥物篩選模型需要滿足在短時間內(nèi)出具藥敏檢測結(jié)果、藥物篩查通量高、預(yù)測效果準確這三個方面，而類器官在這三方面對比其他藥篩方法都顯現(xiàn)出了強勁優(yōu)勢。

            藥篩模型對比（來源：中國網(wǎng)醫(yī)療頻道）
            特點2D細胞模型類器官PDX
            生理變現(xiàn)局限性模型半生理模型生理模型
            構(gòu)建時間短適中較長
            建模成功率高高低
            藥物檢測通量很高高低
            成本低適中高
            樣本量要求少較小活檢/手術(shù)組織較大活檢/手術(shù)組織
            血管化、免疫系統(tǒng)不具備不具備具備
            操作難以程度容易容易困難
            基因編輯容易容易困難
            腫瘤異質(zhì)性難以實現(xiàn)可保留難以實現(xiàn)
            臨床相關(guān)性低高高
            生物庫建立可操作可操作難以實現(xiàn)
            類器官模型的應(yīng)用


            類器官培養(yǎng)

            以小腸類器官培養(yǎng)為例操作方法：

            實驗材料
            名稱
            參數(shù)
            注意
            基質(zhì)膠
            　
            提前化凍
            基礎(chǔ)培養(yǎng)基
            B27 50x；N2  100x；N-Acetyl-L-cysteine1mM；Glutamax100x；HEPES  10mM ；Primocin500x；AdvancedDMEM/F12, ADMEM；細胞因子：Mouse-EGF（鼠源的表皮生長因子）50ng/ml；HumanR-spondin1 500ng/ml；Mouse-noggin（BMP的抑制劑） 100ng/ml
            培養(yǎng)基配置時一次不要太多，建議一次配20ml，配制好后用0.22um的濾器過濾（過濾的目的是除菌），置于4℃可保存4周。
            24孔細胞培養(yǎng)板
            　
            　
            PBS
            　
            滅菌，預(yù)冷且加入雙抗

            實驗方法

            隱窩分離及接板:

            （1）解剖6-8周的小鼠，取胃以下約10cm的小腸，鑷子去腸系膜，剪刀沿腸道剪開，用預(yù)冷的PBS洗3-5次，用載玻片小心的將小腸表面的絨毛刮去（顯微鏡下鏡檢），將刮好的小腸放入50ml離心管中，置于冰上；
            （2）將小腸轉(zhuǎn)移至生物安全柜中，用含雙抗的PBS清洗3-5次，將小腸轉(zhuǎn)移至25ml 2mmol/L的EDTA的溶液中4℃冰箱中消化30min；
            （3）將消化好的小腸轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中用含雙抗的PBS 清洗2次；
            （4）加入25ml PBS適當搖晃30-50下，取部分懸液鏡檢。懸浮液用70um的過濾篩過濾到新的50ml離心管中；
            （5）重復(fù)步驟4，兩次收集的濾液800rpm 離心5min；
            （6）棄上清，用2ml的ADMEM重懸沉淀，取適量的懸液計數(shù)；隱窩的數(shù)量控制在5-15個/ul 最佳；
            （7）取適當體積的懸液加入到1.5ml的離心管中，室溫下800rpm離心5min；
            （8）棄上清，用預(yù)冷的基質(zhì)膠重懸（需充分混勻）；
            （9）接板，24孔板接50ul的重懸液（注：基質(zhì)膠種在孔中間避免貼壁）；
            （10）將接種好的板于培養(yǎng)箱中放置20-30min；
            （11）每孔加500ul培養(yǎng)基，然后每隔2-3天換一次培養(yǎng)基，5-7天傳代一次。
            注：所有的操作都要避免染菌，且組織需盡可能至于冰上。


            小腸培養(yǎng)流程圖
            類器官傳代:

            （1）將傳代的隱窩冰上放置5-10min；
            （2）小心吸出上清，并加入預(yù)冷的1ml 的ADMEM用大槍頭將基質(zhì)膠打碎，然后調(diào)制700ul量程，吹打30下左右，此過程避免產(chǎn)生氣泡。可取適量的懸液觀察，直至看不到大塊的隱窩為止；
            （3）將懸液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，室溫800rpm離心 5min；
            （4）后續(xù)接板步驟與隱窩接板步驟第8-11步一樣。
            注：理論上傳一次可以擴增3-5倍，但由于操作過程中的損失，因此一般只能擴增3倍。

            凍存及復(fù)蘇：

            10%的DMSO，20%FBS，ADMEM補足，將懸液轉(zhuǎn)移至凍存管后，放入凍存盒中于-80℃冰箱中保存24h，若長久保存，24h后需放入液氮罐中保存。復(fù)蘇參照復(fù)蘇細胞方法。

            腫瘤類器官培養(yǎng)方法以腸癌為例：

            實驗材料
            名稱
            貨號
            基質(zhì)膠
            abs9495
            Organotial結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基試劑盒
            abs9445
            試劑盒組成

            組分
            名稱
            規(guī)格
            保存
            A組分
            結(jié)直腸癌類器官緩沖液
            100ml
            4℃
            B組分
            結(jié)直腸癌類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基
            100ml
            4℃
            C組分
            organo原代酶解液
            25ml
            4℃
            D組分
            organo消化液
            25ml
            4℃
            E組分
            organo原代酶終止液
            100ml
            4℃
            F組分
            組織保存液
            100ml
            4℃
            G組分
            organo凍存液
            25ml
            4℃
            實驗方法


            1、原代
            （1）將組織放入含有特殊組織保存液F的組織取樣瓶中放入冰盒4℃，拍照并登記信息。
            （2）取樣瓶消毒，組織放入培養(yǎng)皿，結(jié)直腸癌類器官緩沖液A清洗三次后于培養(yǎng)皿中剪碎，大約1mm3的組織塊。
            （3）癌組織用organo原代酶解液C消化，37℃震蕩消化10-20 min，（消化過程中隨時觀察消化情況）加入三倍體積organo原代酶終止液E終止消化。
            （4）使用100μm孔徑的篩網(wǎng)進行過濾，取少量濾液在鏡下進行觀察，可以看到明顯的組織塊，將濾液收集后于300g富集離心3-5min后移去上清，重新重懸離心。
            （5）去除上清，使用適量基質(zhì)膠（abs9495）進行重懸(24孔板為例，每孔30ul）之后進行鋪板（4℃下操作）拍照追蹤定位。
            （6）將鋪好的板子放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加培養(yǎng)基B（恢復(fù)室溫）進行培養(yǎng)。


            類器官培養(yǎng)流程（基質(zhì)膠法）
            2、類器官傳代培養(yǎng)
            （1）移液器吸去培養(yǎng)基，添加4℃類器官緩沖液A放置一分鐘。
            （2）移液槍輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置5min。
            （3）離心5min棄去液體，添加適量類器官緩沖液A重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體或（添加適量消化液D作用90-120S終止，離心5min棄去混合液）。
            （4）類器官收集后，添加適量類器官凍存液G，按500個/ml密度凍存（或進行步驟5）。
            （5）類器官收集后，基質(zhì)膠重懸，每孔30μl基質(zhì)膠鋪在24孔板中，放置培養(yǎng)箱中10min添加500μl結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基B。

            3、類器官復(fù)蘇
            （1）取10ml于15ml離心管中。
            （2）從液氮罐中取出凍存的腫瘤類器官細胞，快速置于 37℃水浴鍋中融解。
            （3）水浴融解過程中，需輕輕搖動冷凍管，以確保凍存液在 1-2 分鐘內(nèi)融解。
            （4）將溶解后的類器官細胞快速轉(zhuǎn)移至15ml 無菌離心管，使用移液管輕輕吹打3次，300g 離心 3分鐘，然后除去上清液并收集類器官細胞沉淀。添加適量結(jié)直腸癌類器官緩沖液A重懸移入1.5ml離心管300g離心5min。
            （5）基質(zhì)膠重懸，每孔20μl基質(zhì)膠鋪在24控板中，放置培養(yǎng)箱中10min添加500μl結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基B。


            培養(yǎng)基培養(yǎng)腸癌類器官Day1-Day11的培養(yǎng)照
            胃類器官

            基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物
            細胞因子
            小分子化合物
            N2
            EGF
            Y-27623
            N21
            FGF-10
            Gastrin
            N-Acetylcysteine
            Noggin
            A 83-01
            B27
            R-Spondin 1
            Nicotinamide
            Penicillin/Streptomycin  
            Wnt-3a
            SB 202190
            DMEM/F-12


            GlutaminePlus


            結(jié)腸類器官

            基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物
            細胞因子
            小分子化合物
            N2
            EGF
            Y-27623
            N21
            FGF-10
            A 83-01
            N-Acetylcysteine
            Noggin
            Nicotinamide
            B27
            R-Spondin 1
            SB 202190
            Penicillin/Streptomycin  
            Wnt-3a

            DMEM/F-12


            GlutaminePlus


            腦類器官

            基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物
            細胞因子
            小分子化合物
            N2
            BDNF
            Y-27623
            N21
            DKK1
            Dorsomorphin
            N-Acetylcysteine
            EGF
            GDC-0068
            B27
            FGF-basic
            MK-2206
            Penicillin/Streptomycin  
            GDNF

            DMEM/F-12
            Noggin

            GlutaminePlus


            Insulin


            2-mercaptoethanol


            肺類器官

            基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物
            細胞因子
            小分子化合物
            N2
            Activin A
            CHIR 99021
            N21
            FGF- basic
            SB 431542
            N-Acetylcysteine
            Noggin

            B27


            Penicillin/Streptomycin  


            DMEM/F-12


            GlutaminePlus


            肝類器官
            基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物
            細胞因子
            小分子化合物
            N2
            BMP-4
            A 83-01
            N21
            EGF
            DAPT
            N-Acetylcysteine
            FGF-10
            Forskolin
            B27
            HGF
            Nicotinamide
            Penicillin/Streptomycin  
            Noggin
            PGE2
            DMEM/F-12
            R-Spondin 1
            Y-27623
            GlutaminePlus
            Wnt-3a


            FGF- basic


            胰腺類器官
            基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物
            細胞因子
            小分子化合物
            N2
            EGF
            A 83-01
            N21
            FGF-10
            Gastrin
            N-Acetylcysteine
            Noggin
            Nicotinamide
            B27
            R-Spondin 1

            Penicillin/Streptomycin  
            Wnt-3a

            DMEM/F-12


            GlutaminePlus


            腎臟類器官

            基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物
            細胞因子
            小分子化合物
            N2
            Activin A
            CHIR 99021
            N21
            BMP-2
            Retinoic Acid
            N-Acetylcysteine
            BMP-4
            Y-27623
            B27
            BMP-7

            Penicillin/Streptomycin  
            FGF-9

            DMEM/F-12
            FGF- basic

            GlutaminePlus


            前列腺類器官

            基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物
            細胞因子
            小分子化合物
            N2
            Activin A
            A 83-01
            N21
            EGF
            SB 202190
            N-Acetylcysteine
            FGF-10
            Nicotinamide
            B27
            Noggin
            CHIR 99021
            Penicillin/Streptomycin  
            R-Spondin 1
            PGE2
            DMEM/F-12
            Wnt-10b
            Testosterone
            GlutaminePlus
            FGF- basic

            小分子化合物介紹

            產(chǎn)品名稱
            介紹
            A 83-01
             ALK4/ ALK5/ ALK7抑制劑
            Retinoic Acid
            維甲酸信號通路
            CHIR 99021
            GSK-3β抑制劑
            DAPT
             Notch通路抑制劑
            Dorsomorphin
            BMP和AMPK通路抑制劑
            Forskolin
            cAMP激活劑
            Gastrin
            胃泌素
            Nicotinamide
            Sirtuin去乙?；敢种苿?/span>
            PGE2
            前列腺素E2
            SB 202190
            p38 MAPK抑制劑
            Y-27623
            ROCK1抑制劑
            小愛本期推薦


            類器官培養(yǎng)基試劑盒
            培養(yǎng)簡單：培養(yǎng)基集成多種因子，無需添加其他因子和再優(yōu)化；
            擴增效率高：培養(yǎng)的類器官能夠快速增長；
            維持穩(wěn)定傳代：維持至少3代以上擴增，部分類器官每次傳代可實現(xiàn)10代以上擴增；
            性價效益比：按照GMP級別生產(chǎn)條件下制備，批次質(zhì)量穩(wěn)定，價格優(yōu)勢明顯。
             貨號
              品名
              規(guī)格
              abs9446
              Organotial乳腺癌類器官培養(yǎng)基試劑盒
              1kit
              abs9448
              Organotial子宮內(nèi)膜癌類器官培養(yǎng)基試劑盒
              1kit
              abs9445
              Organotial結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基試劑盒
              1kit
              abs9444
              Organotial肝癌類器官培養(yǎng)基試劑盒
              1kit
              abs9443
              Organotial肺癌類器官培養(yǎng)基試劑盒
              1kit
              abs9449
              Organotial胃癌類器官培養(yǎng)基試劑盒
              1kit
              abs9447
              Organotial胰腺癌類器官培養(yǎng)基試劑盒
              1kit

            小分子化合物
             貨號
             品名
             規(guī)格
            abs812864
             Y-27632
             5mg
            abs814916
             Gastrin I (human)
             5mg
            abs817694
             A-83-01
             5mg
            abs810052
            CHIR-99021 (CT99021)
             5mg
             abs810473
             DAPT
             5mg
             abs810530
             Dorsomorphin free base
             5mg
             abs810050
             Forskolin
             5mg
             abs816969
             Nicotinamide
             50mg
             abs810009
            SB202190 (FHPI)
             5mg

            更多相關(guān)產(chǎn)品推薦

            基質(zhì)膠

              貨號
              品名
              規(guī)格
              周期
            abs9410
              即用型基質(zhì)膠
              100ml
              現(xiàn)貨
            abs9490
              基質(zhì)膠（標準型、含酚紅）
              1.5ml*8
              現(xiàn)貨
            abs9491
              基質(zhì)膠（標準型、無酚紅）
              1.5ml*8
              現(xiàn)貨
            abs9492
              基質(zhì)膠（高濃度、含酚紅）
              1.5ml*8
              現(xiàn)貨
            abs9493
              基質(zhì)膠（高濃度、無酚紅）
              1.5ml*8
              現(xiàn)貨
            abs9494
              基質(zhì)膠（低因子、含酚紅）
              1.5ml*8
              現(xiàn)貨
            abs9495
              基質(zhì)膠（低因子、無酚紅）
              1.5ml*8
              現(xiàn)貨
            abs9496
              基質(zhì)膠（IPS驗證無酚紅）
              1.5ml*4
              現(xiàn)貨
            abs9497
              基質(zhì)膠（高濃度、低因子、含酚紅）
              1.5ml*8
              現(xiàn)貨
            abs9498
              基質(zhì)膠(高濃度，無酚紅，低生長因子)
              1.5ml*8
              現(xiàn)貨

            細胞因子
             貨號
              品名
              規(guī)格
              abs04176
             Recombinant Human Epidermal Growth Factor/EGF
             50ug
              abs04695
             Recombinant Human Noggin
             50ug
              abs04398
             Recombinant Human R-Spondin-1/RSPO1 (C-6His)
             50ug
              abs04200
             Recombinant Human Fibroblast Growth Factor 2/FGF-2/FGFb (Pro143-Ser288)
             50ug
              abs04227
             Recombinant Human Fibroblast Growth Factor 4/FGF-4
             50ug
              abs04177
             Recombinant Human Insulin-Like Growth Factor I/IGF-I/IGF1
             50ug
              abs04228
             Recombinant Human Fibroblast growth factor 10/FGF10
             50ug
              abs00939
             Recombinant Human BMP-4
             10ug
              abs04174
             Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein 2/BMP-2
             50ug
              abs04196
             Recombinant Human/Mouse Activin A/INHBA
             50ug
              abs04355
             Recombinant Human Dickkopf-Related Protein 1/DKK1 (N-8His)
             50ug

            參考文獻：
            [1] CORNING. Using Organoids for Disease Modeling. Nov. 11, 2019.
            [2] Lee, J. et al. Nat Commun 11, 4283 (2020).
            [3] SCIENCING. Types of Sea Sponges. 2019.
            [4] Wilson, H. V. Development of sponges from dissociated tissue cells.
            [5] Sato, T. et al. Nature 459, 262–265 (2009).
            [6] Corrò C et al. Am J Physiol Cell Physiol. 2020 Jul 1;319(1):C151-C165.
             
            Absin特色產(chǎn)品線：
            WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標簽抗體、對照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...
             
            愛必信(上海)生物科技有限公司

            
        		
            
        		
			
            
        
            
    
            
	 		 
	
            
		
            
			
            
				
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