間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是來(lái)源于中胚層的多能成體干細(xì)胞，廣泛存在于臍帶、骨髓、脂肪、牙髓、月經(jīng)血等組織，體外培養(yǎng)可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞。
圖1 The Mesengenic Process（圖片來(lái)源于文獻(xiàn)，僅供學(xué)習(xí)參考用）
MSCs具有自我更新能力和多向分化潛能，能夠釋放出許多具有抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)、促血管生成等功能的生物活性因子，可刺激組織器官再生，并且低水平表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類分子，不表達(dá)MHC-Ⅱ類分子，不易激活T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，具有低免疫原性。這些特點(diǎn)和功能使MSCs成為細(xì)胞治療的選擇，美國(guó)臨床信息公示數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，截止今年9月份，共有1583項(xiàng)MSCs的臨床實(shí)驗(yàn)，研究主要集中于心血管疾病、骨關(guān)節(jié)損傷、自身免疫性疾病等。
圖2 MSCs研究者分布和MSCs研究熱點(diǎn)
隨著MSCs的研究如火如荼，不同的分離方法、營(yíng)養(yǎng)體系隨之而來(lái)，如何評(píng)判不同分離方法的MSCs獲得率成為了一個(gè)難題，為了解決這個(gè)問題，2006年，國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)的間充質(zhì)和組織干細(xì)胞委員會(huì)提出了定義人類MSCs的標(biāo)準(zhǔn)。
1、MSCs在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下必須具有塑料粘附性
MSCs具有異質(zhì)性，不同物種，不同組織來(lái)源大小有所差異，例如貓脂肪來(lái)源MSCs臍帶來(lái)源MSCs小，所以無(wú)法單一的從外觀判定MSCs，但是幾乎所有的MSCs都是貼壁生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的貼壁能力，多數(shù)MSCs呈纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，呈梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出突起。傳代后細(xì)胞呈旋渦狀排列生長(zhǎng)。
圖3 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)，僅供學(xué)習(xí)參考用）
2、特異性表面抗原（Ag）的表達(dá)
通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量，95%的MSCs群體必須表達(dá)CD105、CD73和CD90。此外，這些細(xì)胞必須缺乏CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19和HLA II類的表達(dá)（5/2%陽(yáng)性）。
表1 MSCs特異性表面抗原的表達(dá)指標(biāo)
Phenotype | Positive (≥95%) | Negative (≤ 2%) |
| CD105 | CD45 |
| CD73 | CD34 |
| CD90 | CD14或CD11b |
|
| CD79a或CD19 |
|
| HLA II |
3、在體外具有分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞的能力
三系分化能力是MSCs特別的鑒定MSCs的方法，向成骨細(xì)胞的分化可以通過(guò)用茜素紅染色或von Kossa染色來(lái)證明，向脂肪細(xì)胞分化最容易通過(guò)油紅O染色來(lái)證明，成軟骨細(xì)胞分化通過(guò)阿利辛藍(lán)或免疫組織化學(xué)染色來(lái)證明。
圖4 人MSCs成骨分化誘導(dǎo) abs9453
圖5 人MSCs成脂分化誘導(dǎo) abs9454
圖6 人MSCs成軟骨分化誘導(dǎo) abs9455
三系分化小問答：
1、如何解決成骨分化后細(xì)胞極易脫壁的現(xiàn)象？
1）試劑盒內(nèi)含有包被液，可在鋪板前使用；
2）分化時(shí)細(xì)胞匯合度不易過(guò)高，請(qǐng)按照說(shuō)明書指示；
3）多孔樣品換液時(shí)應(yīng)盡量分批迅速，避免細(xì)胞表面干涸，加液時(shí)手法輕柔，不能直接沖擊皿底，換液時(shí)培養(yǎng)基必須復(fù)溫；
4）誘導(dǎo)過(guò)程中更換培養(yǎng)液時(shí)不要清洗，誘導(dǎo)結(jié)束后清洗時(shí)一定要輕柔，避免劇烈晃動(dòng)。
2、成脂分化時(shí)細(xì)胞形態(tài)變差？
1）成脂時(shí)細(xì)胞匯合度一定要達(dá)到90%左右；
2）若用誘導(dǎo)培養(yǎng)基B時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)變差，可以根據(jù)具體情況提前更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基C；
3）誘導(dǎo)過(guò)程中無(wú)需清洗，誘導(dǎo)結(jié)束后清洗時(shí)一定要輕柔，避免劇烈晃動(dòng)。
3、成軟骨誘導(dǎo)后軟骨球不懸浮或者軟骨球碎裂？
1）細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)離心時(shí)，推薦220g離心5min，具體情況可以調(diào)整，以細(xì)胞聚團(tuán)為準(zhǔn)，離心力過(guò)大軟骨球不易懸浮，過(guò)小軟骨球表面易分散；
2）誘導(dǎo)后24 小時(shí)內(nèi)避免搖動(dòng)細(xì)胞沉淀，以確保形成個(gè)團(tuán)塊。離心管需使用聚丙烯材質(zhì)無(wú)菌管；
3）注意開關(guān)培養(yǎng)箱門時(shí)動(dòng)作要輕柔，不要震動(dòng)。
4、軟骨球是否可以做冰凍切片？
可以，做冰凍切片時(shí)固定后可以用蔗糖梯度脫水，若不及時(shí)切片染色，需用鋁箔紙包裹，保存在-80℃。
MSCs鑒定相關(guān)的講解就到這里啦，老師們有細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)問題，歡迎公眾號(hào)“愛必信生物"后臺(tái)留言。
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參考文獻(xiàn)
[1] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement[J]. Cytotherapy, 2006, 8(4): 315-317.
[2] Caplan A I, Correa D. The MSC: an injury drugstore[J]. Cell stem cell, 2011, 9(1): 11-15.
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