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概述

基質(zhì)膠是從小鼠腫瘤組織提取的基底膜成分（基底膜是動物體內(nèi)上皮細(xì)胞基底面的一層基質(zhì)膜），所形成的基質(zhì)膠?；|(zhì)膠主要成分為層粘連蛋白，Ⅳ型膠原蛋白，巢蛋白。同時，基質(zhì)膠也包含多種生長因子，例如表皮生長因子EFG，血小板衍生生長因子PDGF，神經(jīng)生長因子NGF，堿性成纖維細(xì)胞生長因子FGF-2，乙型轉(zhuǎn)化生長因子TGF-beta和胰島素樣生長因子ILGF（Vukicevic et al.1992）。

基底膜在小鼠腫瘤組織中的位置分布

基質(zhì)膠在各實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域中的應(yīng)用

1、小鼠成瘤實(shí)驗(yàn)

動物實(shí)驗(yàn)由于其更能模擬人類的生理和病理?xiàng)l件，在腫瘤研究中，最常規(guī)的動物實(shí)驗(yàn)就是裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)。由于大部分腫瘤研究使用的是人類細(xì)胞，所以由于異種排斥的存在，我們需要免疫缺陷型小鼠來作為移植瘤模型的載體，通過對該小鼠的注射腫瘤細(xì)胞，使其成瘤，觀察流體的生長來判斷其生物學(xué)變化。

試劑材料

基質(zhì)膠（高濃度，無酚紅）(abs9493)

操作步驟

1）收集用于注射小鼠的細(xì)胞5*10⁶個，以1:1的體積與基質(zhì)膠混合，為方便注射，建議每次注射總體積不低于100µL；

2）用脫毛器對小鼠注射部位皮膚進(jìn)行脫毛，然后用酒精棉球進(jìn)行消毒；

3）用不帶針頭的1mL注射器將細(xì)胞和膠的混合物吸入針頭，再裝上16g的針頭（針頭內(nèi)直徑為1.194mm）， 將混合物注射到皮下，或者大腿肌肉（針對代謝特別旺盛的腫瘤細(xì)胞）。

注意事項(xiàng)：

1）動物選擇：一般選擇4-6周齡Nude裸鼠，需要提前到SPF環(huán)境中適應(yīng)1周；

2）接種部位與接種量：接種部位常為皮下，靜脈或原位；細(xì)胞量一般是5*10⁶個/200µL，但是不同的細(xì)胞系的接種量略有差別；

3）成瘤時間：皮下接種的細(xì)胞一般會在1-2周成瘤，一般不會超過1個月；尾靜脈和腹腔接種的細(xì)胞一般也是1周左右，需要密切觀察動物的體重與狀態(tài)進(jìn)行判斷；

4）注射的時候一定要注意別打漏了或者打到肌肉里，這樣出來的瘤體積一致性很差。一般采用進(jìn)針以后針尖向上挑，打的體積不超過200µL。

基質(zhì)膠成瘤對比實(shí)驗(yàn)

使用Absin高濃度基質(zhì)膠，小鼠皮下瘤體積后期顯著高于對照組和C品牌。

2、類器官培養(yǎng)

類器官屬于三維(3D)細(xì)胞培養(yǎng)物，包含其代表器官的一些關(guān)鍵特性。此類體外培養(yǎng)系統(tǒng)包括一個自我更新干細(xì)胞群，可分化為多個器官器官特異性的細(xì)胞類型，與對應(yīng)的器官擁有類似的空間組織并能夠重現(xiàn)對應(yīng)器官的部分功能，從而提供一個高度生理相關(guān)系統(tǒng)。類器官可以從成體干細(xì)胞(ASCs)、多能干細(xì)胞(PSCs)（即胚胎干細(xì)胞或ESCs），或誘導(dǎo)的PSCs(iPSCs)中衍生。類器官培養(yǎng)系統(tǒng)主要包括基質(zhì)膠、維持類器官生態(tài)所需因子和分化所需因子這幾個主要元素?；|(zhì)膠中含有膠原、巢蛋白和纖連蛋白等等，為類器官形成三維空間結(jié)構(gòu)提供基質(zhì)。維持類器官生態(tài)因子主要目的為促進(jìn)細(xì)胞的增殖和抑制細(xì)胞凋亡等。

類器官培養(yǎng)流程

以人腸癌類器官培養(yǎng)為例

試劑耗材

人腸癌類器官培養(yǎng)基試劑盒(abs9445)、基質(zhì)膠（低因子、無酚紅）(abs9495)、60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(abs7005)、100μm濾篩(abs7009)、15mL離心管(abs7102)、1.5mL EP管若干(abs7119)、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(abs7058)、金屬冰盒、眼科剪刀、眼科鑷

人腸癌類器官培養(yǎng)基試劑盒(abs9445)

試劑盒組成

基質(zhì)膠（低因子、無酚紅）(abs9495)

操作步驟

1）類器官操作流程之——樣本準(zhǔn)備

a.將組織放入含有預(yù)冷的（2-8°C）組織保存液E的取樣瓶中（浸沒整個組織），4℃從醫(yī)院/實(shí)驗(yàn)室取回；

b.將取樣瓶消毒，組織取出放入培養(yǎng)皿樣本拍照，并登記大小，顏色，軟硬程度，組織類型等信息。

2）類器官操作流程之——清洗-剪碎

在60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(abs7005)里用2-3mL原代培養(yǎng)緩沖液B浸泡。用原代培養(yǎng)緩沖液B清洗三次（每次更換培養(yǎng)皿）后剪碎，剪成大約1-3mm³的組織塊，轉(zhuǎn)移至15mL離心管。

3）類器官操作流程之——消化-過濾

a.向15mL離心管中加入人腸癌原代組織消化液C（消化液是組織體積的3-5倍）在37℃進(jìn)行消化10-15min（消化過程中隨時觀察消化情況）；

b.取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的細(xì)胞團(tuán)（5-10個細(xì)胞抱團(tuán)）后， 加入3倍體積原代培養(yǎng)緩沖液B終止消化，用槍頭輕柔吹打可以看到液體變渾濁；

c.使用100μm濾篩(abs7009)進(jìn)行過濾，取少量濾液在鏡下進(jìn)行觀察。將濾液收集到15mL離心管，于300g 4℃富集離心5min后移去上清，添加1mL左右原代培養(yǎng)緩沖液B轉(zhuǎn)移到1.5mL EP管，重新重懸離心。

4）類器官操作流程之—離心、加膠

基質(zhì)膠計算：第3步后觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質(zhì)膠(abs9495)重懸鋪板（金屬冰盒或冰上操作）。

5）類器官操作流程之——點(diǎn)膠-加液

以24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例，每孔點(diǎn)膠25uL組織基質(zhì)膠混合物進(jìn)行鋪板（金屬冰盒或冰上操作），將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL人腸癌類器官培養(yǎng)基A進(jìn)行培養(yǎng)。

類器官培養(yǎng)對比

使用Absin低因子基質(zhì)膠，腸癌類器官數(shù)量和體積顯著大于某進(jìn)口品牌。

使用Absin低因子基質(zhì)膠，腸癌類器官數(shù)量顯著大于友商品牌且熒光染色類器官形態(tài)更完整。人膽管類器官由細(xì)胞核染料DAPI（藍(lán)色），緊密連接蛋白抗體anti-ZO1和細(xì)胞骨架蛋白F-actin的染料 Alexa Fluor 647 Phalloidin染色成像。

使用Absin低因子基質(zhì)膠，肝癌類器官染色效果和友商品牌效果相當(dāng)。肝癌類器官由細(xì)胞核染料DAPI（藍(lán)色），肝臟細(xì)胞生物標(biāo)志物HNF4a和肝癌標(biāo)志物GPC3的抗體染色成像。

3、血管生成實(shí)驗(yàn)

血管生成(Angiogenesis)是指源于已存在的毛細(xì)血管和毛細(xì)血管后微靜脈新的毛細(xì)血管性血管的生長。血管生成參與了需對疾病的病理變化，無論原發(fā)性腫瘤還是繼發(fā)性腫瘤，一日生長直徑超過1-2mm，都會有血管生成。這是由于腫瘤細(xì)胞自身可分泌多種生長因子誘導(dǎo)血管生成?？刂蒲苌捎欣诙喾N疾病的治療，從病理學(xué)角度研究疾病狀態(tài)下的血管生成和消退規(guī)律，采取有效的血管治療策略以及開展器官轉(zhuǎn)移等研究均有十分重要的意義。其中小管形成實(shí)驗(yàn)是測量在體外血管生成一種快速的可量化的方法。

以永生化HUVEC細(xì)胞系為例：

試劑材料

基質(zhì)膠（標(biāo)準(zhǔn)型，無酚紅）(abs9491)、胎牛血清(abs972)、HUVEC細(xì)胞(5*10⁴ per well)、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(abs7036)、青霉素-鏈霉素溶液（100×，雙抗）(abs9244)、DMEM高糖培養(yǎng)基（含L-谷氨酰胺，含丙酮酸鈉，不含HEPES）(abs9483)

實(shí)驗(yàn)步驟

1）將培養(yǎng)基換成饑餓細(xì)胞用培養(yǎng)基：加入含0.2% FBS，1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；

2）將基質(zhì)膠均勻鋪滿96孔板底。

注意：槍頭需提前預(yù)冷30min。盡量在冰上操作，避免基質(zhì)膠過早固化，避免氣泡產(chǎn)生；

3）將96孔板在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30min，固化基質(zhì)膠；

4）消化HUVEC細(xì)胞，并計數(shù)；

5）將200µL的HUVEC細(xì)胞懸液（含5*10⁴個細(xì)胞）加于含基質(zhì)膠的96孔板中。將96孔板放于培養(yǎng)箱；

6）血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)將于3-12h形成；

7）在血管網(wǎng)絡(luò)形成最佳時間，小心去除培養(yǎng)基，并用加入含活細(xì)胞染料1/1000 Calcein AM（綠色）的培養(yǎng)基進(jìn)行染色，并用顯微鏡進(jìn)行拍照記錄。

使用Absin標(biāo)準(zhǔn)型基質(zhì)膠以及外友商基質(zhì)膠，均可使人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)形成血管網(wǎng)絡(luò)。

4、細(xì)胞侵襲

Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于各種細(xì)胞因子對惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及一些抑制血管生成的新藥研究。Transwell實(shí)驗(yàn)原理就是將transwell小室放入培養(yǎng)板中，并將高營養(yǎng)液與低營養(yǎng)液用一層膜隔開，細(xì)胞放在低營養(yǎng)液中，而為了獲得更多的營養(yǎng)，細(xì)胞則會穿過這層膜，進(jìn)入高營養(yǎng)液。細(xì)胞transwell實(shí)驗(yàn)，可作為一種非常簡便的研究腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲以及轉(zhuǎn)移情況的方法。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)原理圖

實(shí)驗(yàn)材料

基質(zhì)膠（標(biāo)準(zhǔn)型，無酚紅）(abs9491)、胎牛血清(abs972)、PBS(abs962)、BSA(abs9156)、DMEM高糖培養(yǎng)基（含L-谷氨酰胺，含丙酮酸鈉，不含HEPES）(abs9483)、24孔板細(xì)胞培養(yǎng)小室配套培養(yǎng)板(abs7282)、上層培養(yǎng)液：DMEM加入0.05%-0.2%BSA、下層培養(yǎng)液：DMEM加入5%-10%FBS

實(shí)驗(yàn)步驟

1）鋪基質(zhì)膠：在4℃條件下將基質(zhì)膠用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS緩沖液按照1:8比例稀釋（其稀釋比例需要摸索，選擇一個細(xì)胞穿過適中的濃度即可），取100uL均勻涂抹于上室的聚碳酸酯膜表面，37℃放置0.5-1h，使其聚合成凝膠。

注意：

a.將槍頭沿小室內(nèi)壁將基質(zhì)膠輕輕打出，切忌戳到小室濾膜；

b.加入的基質(zhì)膠的體積不可太大。把聚碳酸酯膜浸濕即可；

c.注意低溫，槍頭、小室等都應(yīng)該4℃預(yù)冷。

2）細(xì)胞培養(yǎng)：取對數(shù)生長期的待測細(xì)胞，并用PBS洗滌，接著用上層培養(yǎng)基（DMEM加入0.05%-0.2%BSA）懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1-10*10⁵/mL。

3）接種細(xì)胞：在24孔板下室一般加入500-650uL下層培養(yǎng)液（DMEM加入5%-10%FBS），然后用鑷子將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，取細(xì)胞懸液100-200µL加入上室，最后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-48h（根據(jù)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力而定）。

注意：

a.盡量避免氣泡的產(chǎn)生：下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，會影響下層培養(yǎng)液的趨化作用。因此一旦出現(xiàn)大氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板；

b.注意細(xì)胞一定要接種均勻，建議沿著壁緩慢加入；

c.時間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力以外，處理因素對細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視如某些藥物會抑制細(xì)胞的增殖。

4）細(xì)胞固定：取出小室，吸走培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦拭基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞。取新的24孔板加入4%多聚甲醛600µL，將小室放入后固定20-30min。

5）細(xì)胞染色及計數(shù)：棄固定液，用0.1%-0.2%結(jié)晶紫染色5-10min， PBS洗3遍，除去未與細(xì)胞結(jié)合的結(jié)晶紫，用棉簽輕輕擦拭小室的上側(cè)，將非特異性結(jié)合于小室上表面的染料擦掉，以便后續(xù)鏡檢。適當(dāng)風(fēng)千后，在高倍顯微鏡下選取5個視野觀察細(xì)胞并計數(shù)。

常見細(xì)胞每孔接種數(shù)量推薦（僅參考）

5、細(xì)胞遷移

細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)方法相似，區(qū)別點(diǎn)在于細(xì)胞遷移不需要基質(zhì)膠包被。

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)原理圖

實(shí)驗(yàn)試劑

胎牛血清(abs972)、DMEM(abs9483)、PBS(abs962)、BSA(abs9156)、24孔板細(xì)胞培養(yǎng)小室配套培養(yǎng)板(abs7282)、上層培養(yǎng)液：DMEM加入0.05%-0.2%BSA、下層培養(yǎng)液：DMEM加入5%-10%FBS

實(shí)驗(yàn)步驟

1）細(xì)胞培養(yǎng)：取對數(shù)生長期的待測細(xì)胞，并用PBS洗滌，接著用上層培養(yǎng)基（DMEM加入0.05%-0.2%BSA）懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1-10*10⁵/mL。

2）接種細(xì)胞：在24孔板下室一般加入500-650uL下層培養(yǎng)液（DMEM加入5%-10%FBS）（有些特殊實(shí)驗(yàn)可以加趨化因子）。然后用鑷子將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，取細(xì)胞懸液100-200µL加入上室，最后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-48h（根據(jù)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力而定）。

注意：

a.盡量避免氣泡的產(chǎn)生:下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，會影響下層培養(yǎng)液的趨化作用。因此一旦出現(xiàn)大氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板；

b.注意細(xì)胞一定要接種均勻，建議沿著壁緩慢加入；

c.時間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力以外，處理因素對細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視如某些藥物會抑制細(xì)胞的增殖。

3）細(xì)胞固定：取出小室，吸走培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦拭上室內(nèi)的細(xì)胞。取新的24孔板加入4%多聚甲醛600µL，將小室放入后固定20-30min。

4）細(xì)胞染色及計數(shù)：棄固定液，用0.1%-0.2%結(jié)晶紫染色5-10min，PBS洗3遍，除去未與細(xì)胞結(jié)合的結(jié)晶紫，用棉簽輕輕擦拭小室的上側(cè)，將非特異性結(jié)合于小室上表面的染料擦掉，以便后續(xù)鏡檢。適當(dāng)風(fēng)千后，在高倍顯微鏡下選取5個視野觀察細(xì)胞并計數(shù)。

今天講解就到這了，大家如有實(shí)驗(yàn)問題，歡迎公眾號“愛必信生物"后臺私信留言交流哦！

*注：文中部分圖源于網(wǎng)絡(luò)，僅供學(xué)習(xí)參考用。

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