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            首頁(yè)   >>   技術(shù)文章   >>   分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)“酶”你不行!

            愛(ài)必信(上海)生物科技有...

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            分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)“酶”你不行!

            閱讀:685      發(fā)布時(shí)間:2024-5-14
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            做了這么多年的分子實(shí)驗(yàn),對(duì)于其中的工具酶大家都了解嗎?他們的作用原理都知道嗎?本期Absin分子小課堂小愛(ài)要教大家如何分清這些復(fù)雜的酶。

             

            工具酶是一類在DNA重組過(guò)程中,用于不同DNA分子的制備、切割、修飾、擴(kuò)增、核酸分子的標(biāo)記以及核苷酸序列測(cè)定的酶的統(tǒng)稱,是基因重組技術(shù)所需的工具。根據(jù)催化反應(yīng)特性可分為限制性內(nèi)切酶、聚合酶、連接酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等多種類型。

             

             

            限制性內(nèi)切酶

             

            限制性內(nèi)切酶主要從原核生物中發(fā)現(xiàn),以內(nèi)切方式水解核酸中磷酸二酯鍵,對(duì)外源性的DNA進(jìn)行切割、水解,被稱為“基因剪刀"。限制酶來(lái)源于細(xì)菌的“限制—修飾"系統(tǒng),最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)60年代末。根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu)與作用方式,可將其分為Ⅰ類限制酶(TypeⅠ)、Ⅱ類限制酶(TypeⅡ)和Ⅲ類限制酶(TypeⅢ)3種類型。其中,Ⅱ類限制酶識(shí)別切割位點(diǎn)比較專一,且不具有甲基化酶的活性,在DNA重組中被廣泛應(yīng)用。

             

            愛(ài)必信擁有不同的TypeⅡ型限制性內(nèi)切酶產(chǎn)品:

            產(chǎn)品優(yōu)勢(shì):

            1、快速:5-15min內(nèi)即可完成酶切;

            2、便捷:共用一種酶切Buffer,簡(jiǎn)化酶切體系;

            3、兼容性高:在不同緩沖液中均具有很高活性;

            4、良好酶活冗余度,輕松應(yīng)對(duì)底物過(guò)量或困難模板酶切。


            貨號(hào)

            產(chǎn)品名稱

            規(guī)格

            abs60200

            快速內(nèi)切酶ApaLI

            200T

            abs60201

            快速內(nèi)切酶AscI

            50T

            abs60202

            快速內(nèi)切酶AvrII

            25T

            abs60203

            快速內(nèi)切酶BamHI

            500T

            abs60204

            快速內(nèi)切酶BclI

            125T

            abs60205

            快速內(nèi)切酶BglII

            100T

            abs60206

            快速內(nèi)切酶BsaI

            50T

            abs60207

            快速內(nèi)切酶BstBI

            100T

            abs60208

            快速內(nèi)切酶BstEII

            100T

            abs60209

            快速內(nèi)切酶ClaI

            50T




             

             

            DNA連接酶

             

            DNA連接酶主要用于基因工程中,將由限制性核酸內(nèi)切酶“剪"出的粘性末端重新組,故也稱“基因針線"。作用原理為DNA連接酶催化雙鏈DNA鏈一條鏈上切口的連接,借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-Po4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。T4 DNA連接酶是ATP依賴的DNA連接酶,可催化雙鏈DNA的粘性末端、平末端及RNA-DNA雜合體中單鏈的連接,在分子生物學(xué)中有廣泛的應(yīng)用。


            貨號(hào)

            產(chǎn)品名稱

            規(guī)格

            特點(diǎn)

            abs60084

            T4 DNA Ligase

            500U

            該酶不僅能夠催化雙鏈DNA的平末端或粘性末端之間的連接,還可以修復(fù)雙鏈DNA、RNA或DNA/RNA雜交雙鏈中的單鏈切刻。




             

            DNA聚合酶(DNA polymerase)

             

            DNA聚合酶以DNA為復(fù)制模板,從將DNA由5'端點(diǎn)開(kāi)始復(fù)制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成(在具備模板、引物、dNTP等的情況下)及其相輔的活性。實(shí)驗(yàn)室常用的DNA聚合酶有普通耐熱型Taq DNA聚合酶、高保真型DNA聚合酶。


            貨號(hào)

            產(chǎn)品名稱

            規(guī)格

            abs60251

            重組高熱穩(wěn)定DNA聚合酶

            1000U

            abs60036

            2×Taq PCR Mix

            1mL*5

            abs60056

            2×Pfu Master Mix

            1mL*5

            abs601511

            2 × 預(yù)混實(shí)時(shí)熒光定量快速PCR反應(yīng)體系

            1.7mL*3




             

            逆轉(zhuǎn)錄酶

             

            逆轉(zhuǎn)錄酶(反轉(zhuǎn)錄酶)又稱為依賴RNA的DNA聚合酶。該酶以RNA為模板,以dNTP為底物,根據(jù)堿基配對(duì)的原則,按5'-3'方向合成一條與RNA模板互補(bǔ)的DNA單鏈,這條DNA單鏈叫做互補(bǔ)DNA (complementary DNA, CDNA)。


            貨號(hào)

            產(chǎn)品名稱

            規(guī)格

            產(chǎn)品特點(diǎn)

            abs60073

            Reverse Transcriptase

            10000U

            本酶的RNase H活性缺失,延伸能力強(qiáng),可用于較長(zhǎng)的cDNA合成,高比例的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建以及Real Time RT-PCR反應(yīng)等。





            核酸酶

             

            核酸酶主要有三類,分別是:

            1、脫氧核糖核酸酶(DNase):DNase只能水解DNA的磷酸二酯鍵。胰DNasel可切割雙鏈和單鏈DNA,產(chǎn)物為5’-磷酸寡核首酸,牛脾DNasell降解DNA則產(chǎn)生3’-磷酸為未端的寡核苷酸;

            2、核糖核酸酶(RNase):將RNA降解為小片段的核酸酶;

            3、非特異性核酸酶:將DNA、RNA都可進(jìn)行水解。


            貨號(hào)

            產(chǎn)品名稱

            規(guī)格

            abs60539

            脫氧核糖核酸酶Ⅰ

            1KU

            abs47047435

            脫氧核糖核酸酶Ⅰ(牛胰)

            100mg

            abs9330

            核糖核酸酶A

            150uL

            abs44075580

            核糖核酸酶A

            50mg

            abs60326

            DNase–Free RNA酶A

            1mL

            abs60157

            全能核酸酶

            10KU




             

            其他酶


            貨號(hào)

            產(chǎn)品名稱

            規(guī)格

            產(chǎn)品描述

            abs60248

            雙鏈DNA酶

            50T

            dsDNase也是一種核酸內(nèi)切酶,能夠特異性的消化雙鏈DNA而不會(huì)消化單鏈DNA

            abs60340

            PfAgo核酸內(nèi)切酶

            200U

            PfAgo核酸內(nèi)切酶可在5’磷酸化的guide DNA引導(dǎo)下精準(zhǔn)剪切單鏈DNA底物

            abs9118

            蛋白酶K

            1g

            主要應(yīng)用于基因診斷試劑盒、基因組DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒中去除核酸酶和其它蛋白污染




             

            FAQ

             

            1、限制性內(nèi)切酶無(wú)法切割DNA有哪些原因?

            a. 內(nèi)切酶失活:用標(biāo)準(zhǔn)底物檢測(cè)酶活性;

            b. DNA不純,含有SDS、酚、EDTA等內(nèi)切酶抑制因子:將DNA過(guò)柱純化,乙醇沉淀DNA;

            c. 條件不適(試劑、溫度):檢查反應(yīng)系統(tǒng)是否最佳;

            d. DNA不存在該酶識(shí)別序列:換用其它的酶切割DNA或過(guò)量酶消化驗(yàn)證。

             

            2、酶切后的DNA片段連接效率低?

            a. 含磷酸鹽的濃度高:透析,乙醇沉淀去除磷酸鹽;

            b. 內(nèi)切酶失活或含有ATP酶:更換內(nèi)切酶;

            c. 平末端連接:加大T4 DNA Ligase用量;

            d. 連接緩沖液不合適:重新配制連接緩沖液。

             

            3、脫氧核糖核酸酶I(abs60539)濃度、體積怎么換算?用于組織的解離該怎么用?

            對(duì)于濃度、體積計(jì)算:本產(chǎn)品規(guī)格為1KU,酶活濃度是5U/mL,總體積則為200uL。根據(jù)說(shuō)明書(shū)最后一個(gè)表格計(jì)算酶體積用量:例如1ugRNA,相應(yīng)所需酶就是1U,1KU/1U=200uL/需要體積,最后計(jì)算得到0.2uL。對(duì)于動(dòng)物組織解離,可以適用,具體操作步驟及使用量可參考網(wǎng)絡(luò)文獻(xiàn)。

             

            4、pfAgo核酸內(nèi)切酶buffer是否含有金屬離子?

            Buffer中不含金屬離子,對(duì)于擴(kuò)增反應(yīng)沒(méi)有任何影響。一般PfAgo酶可以兼容絕大多數(shù)PCR buffer,但普通Taq酶不兼容PfAgo buffer。

             

            5、pfAgo核酸內(nèi)切酶和Ago核酸內(nèi)切酶(微球)有哪些差別?

            兩者狀態(tài)不一樣、保存條件不一樣;檢測(cè)方法、使用的效果幾乎一樣。

             

            名詞解釋:

             

            酶活性單位:在一定溫度、PH及離子強(qiáng)度下,1h內(nèi)酶解(切割)特定底物DNA,所需酶的量。采用國(guó)際單位(IU,簡(jiǎn)寫(xiě)為U)來(lái)統(tǒng)一表示酶活性的大小。

            酶活性濃度:以每單位體積所含的酶活性單位數(shù)表示。目前幾乎都習(xí)慣用U/L來(lái)表示液體中酶活性濃度。


            Absin產(chǎn)品線:
            爆款產(chǎn)品:試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測(cè)、殘留檢測(cè)、多因子檢測(cè));細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠,胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒;分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒);化合物大包裝;輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...
            特色產(chǎn)品:雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...


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