免疫組化(IHC)是一種用于檢測(cè)組織或細(xì)胞中特定蛋白質(zhì)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究和診斷中非常重要，但實(shí)驗(yàn)過程中可能會(huì)遇到一些問題。讓小愛帶你來看看常見問題的應(yīng)對(duì)策略吧~
無(wú)染色
1、一抗和二抗不兼容
- 使用抗一抗種屬來源的二抗（例如，如果一抗是兔來源的，則使用抗兔的二抗）。確認(rèn)二抗是否識(shí)別一抗的亞型。
2、沒有足夠的一抗與目的蛋白結(jié)合
- 使用更高濃度的抗體。
- 4℃下長(zhǎng)時(shí)間孵育（如過夜孵育）。
3、抗體可能不適用于IHC，因?yàn)槠淇赡軣o(wú)法識(shí)別蛋白的天然(3D)形式
- 查看抗體使用說明書，確認(rèn)抗體是否經(jīng)過IHC驗(yàn)證以及驗(yàn)證的IHC類型（福爾馬林或PFA固定、冰凍切片等）。在ICC或IP中成功使用抗體也能說明抗體可以識(shí)別天然形式的蛋白。
- 在天然（非變性）WB中檢測(cè)抗體，以確保其仍然有效。
4、一抗/二抗/信號(hào)放大試劑盒可能因儲(chǔ)存不當(dāng)、稀釋不當(dāng)或多次反復(fù)凍融而失去活性
- 設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，以確保這些試劑仍然有效。
5、該蛋白不存在于目標(biāo)組織中
- 設(shè)置文獻(xiàn)中或抗體供應(yīng)商推薦的陽(yáng)性對(duì)照。
6、目的蛋白在組織中含量并不豐富
- 采用信號(hào)放大步驟，將信號(hào)zui大化。
7、二抗未避光保存（進(jìn)行熒光檢測(cè)時(shí)）
- 始終避免二抗暴露于光照中。
8、脫蠟可能不充分
- 延長(zhǎng)切片的脫蠟時(shí)間，使用新配制的二甲苯。
9、固定步驟可能會(huì)改變抗體識(shí)別的抗原表位
- 使用不同的抗原修復(fù)方法來暴露抗原表位（包括使用pH值為6或9的緩沖液進(jìn)行熱抗原修復(fù)、酶抗原修復(fù)等）。
- 縮短切片固定時(shí)間。
10、抗體不能穿透蛋白所定位的細(xì)胞核（核蛋白）。
- 向封閉緩沖液和抗體稀釋液中加入強(qiáng)效通透劑（如Triton™ X-100，貨號(hào)：abs9149）。
11、PBS緩沖液被細(xì)菌污染，細(xì)菌會(huì)破壞目的蛋白上的磷酸基團(tuán)（磷酸化蛋白）
- 在PBS抗體儲(chǔ)存緩沖液中加入0.01%疊氮化物或使用新配制的無(wú)菌PBS。
12、抗原修復(fù)不全，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合
- 建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過實(shí)驗(yàn)，這是最佳的時(shí)間和次數(shù)。若不行，還可高壓修復(fù)。
非特異染色
1、一抗/二抗?jié)舛瓤赡苓^高
- 嘗試降低抗體濃度或縮短孵育時(shí)間。與不表達(dá)靶蛋白的組織的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較。
2、內(nèi)源性過氧化物酶具有活性
- 使用酶抑制劑，即對(duì)AP使用左旋咪唑(2mM)，或?qū)^氧化物酶使用H2O2(0.3% v/v)。
3、使用與染色組織相同種屬來源的一抗（例如在小鼠組織上使用小鼠一抗）。應(yīng)用二抗時(shí)，由于二抗是靶向組織種屬的，與組織中的免疫球蛋白或蛋白的Fc片段結(jié)合
- 使用種屬來源與組織切片不同的一抗，或用F(ab)片段二抗封閉。
4、切片/細(xì)胞已干燥
- 保持切片/細(xì)胞高度濕潤(rùn)，勿讓其變干。
5、一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色
- 建議試用單克隆抗體看看。
6、非特異性組分與抗體結(jié)合
- 這需要通過延長(zhǎng)二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果。
組織形態(tài)不清晰或受損
1、抗原修復(fù)方法可能過于苛刻
- 改變抗原修復(fù)步驟或嘗試不同的抗原修復(fù)方法。
2、組織可能未充分固定
- 延長(zhǎng)固定時(shí)間。
- 提高固定劑與組織的比例。
- 切割更小塊的組織，進(jìn)行更有效的固定（浸泡固定）。
3、組織切片從載玻片上脫落（冰凍切片）
- 延長(zhǎng)固定時(shí)間。
- 嘗試更換固定劑。
- 使用新鮮制備的載玻片。
4、組織切片撕裂或折疊，或切片下方可見氣泡
- 使用鋒利的刀片重新切片。
- 研究不受影響的組織區(qū)域。使用PAP筆（貨號(hào)：abs929）定位試劑。
5、組織形態(tài)難以分辨
- 將組織切片切的更薄。
- 冰晶可能破壞切片形態(tài)
- 重新切片，快速冷凍（冷凍切片）。
6、組織自溶
- 延長(zhǎng)固定時(shí)間。
- 增加固定劑相對(duì)于組織的比例。
- 嘗試使用交聯(lián)固定劑。
高背景
1、沒有對(duì)非特異性結(jié)合進(jìn)行封閉或封閉不充分
- 延長(zhǎng)封閉時(shí)間，并考慮更換封閉試劑。如果使用血清，我們推薦使用二抗種屬的10%正常血清封閉1h（貨號(hào)：abs933）?；蛘撸瑖L試采用商品化的封閉緩沖液，或使用樣本種屬免疫球蛋白預(yù)吸附的二抗。
2、一抗?jié)舛瓤赡苓^高
- 測(cè)試抗體的最佳濃度，梯度稀釋抗體，并在4℃下孵育。
3、孵育溫度可能過高
- 4℃下孵育切片。
4、二抗可能存在非特異性結(jié)合
- 使用不加一抗的二抗對(duì)照。
- 如果在單獨(dú)使用二抗時(shí)觀察到著色，則應(yīng)更換二抗，或使用樣本種屬免疫球蛋白預(yù)吸附的二抗。
5、組織洗滌不充分；仍然存在固定劑
- 各個(gè)步驟之間，用PBS或TBS充分洗滌組織。添加表面活性劑，例如0.1% Triton。
6、內(nèi)源性過氧化物酶具有活性
- 使用酶抑制劑，即對(duì)AP使用左旋咪唑(2mM)，或?qū)^氧化物酶使用H2O2 (0.3% v/v)。
7、固定步驟導(dǎo)致自發(fā)熒光（如果使用熒光檢測(cè)）
- 福爾馬林/PFA通常會(huì)在綠色光譜中產(chǎn)生自發(fā)熒光，因此可以嘗試使用紅色光譜范圍內(nèi)的熒光基團(tuán)。
- 如果有可用的紅外檢測(cè)系統(tǒng)，則使用紅外范圍內(nèi)的熒光基團(tuán)。
8、組織內(nèi)自發(fā)熒光（如果使用熒光檢測(cè)）
-如果自發(fā)熒光不需要保留，可以使用組織自發(fā)熒光淬滅劑（貨號(hào)：abs9860）
9、信號(hào)放大過多（間接檢測(cè)技術(shù)）
- 縮短信號(hào)放大試劑孵育時(shí)間，稀釋二抗或信號(hào)放大試劑。
10、底物過多（酶檢測(cè)）
- 進(jìn)一步稀釋底物，或縮短底物孵育時(shí)間。
11、色原與組織樣品中存在的PBS反應(yīng)（酶檢測(cè)）
- 先使用Tris緩沖液洗滌切片，再與底物一起孵育，然后在Tris緩沖液中洗滌切片/細(xì)胞（特別注意，僅適用于AP）。
IHC實(shí)驗(yàn)雖然在技術(shù)上要求較高，但通過仔細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、嚴(yán)格的操作流程和及時(shí)的問題解決，可以獲得高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。面對(duì)IHC實(shí)驗(yàn)中的問題，研究人員需要耐心和細(xì)致，不斷優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，以確保實(shí)驗(yàn)的成功。
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