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            免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之后續(xù)研究

            閱讀:667      發(fā)布時(shí)間:2024-10-15
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            概述

             

            免疫細(xì)胞培養(yǎng)的六個(gè)基本流程:樣本制備、細(xì)胞分選、分型鑒定、擴(kuò)增&培養(yǎng)、質(zhì)量?jī)?yōu)化、后續(xù)研究。小愛已經(jīng)給大家詳細(xì)介紹了《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之樣本制備(一)》《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之細(xì)胞分選(二)》、《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之分型鑒定(三)》、《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之擴(kuò)增&培養(yǎng)(四)》、《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之質(zhì)量?jī)?yōu)化(五)》今天我們繼續(xù)來了解一下后續(xù)研究。

             

            后續(xù)研究(Follow-Up Study):運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、ELISA、細(xì)胞共培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究免疫細(xì)胞的功能(殺傷能力、分泌細(xì)胞因子、吞噬功能、增殖能力等)。免疫細(xì)胞可以做的后續(xù)研究實(shí)在是太多了,比如:CAR-T/NK/M,腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)、類器官免疫共培養(yǎng),細(xì)胞因子風(fēng)暴等等,小愛在這里拋磚引玉,給大家介紹3個(gè)免疫細(xì)胞研究的熱門思路:NK細(xì)胞殺傷能力鑒定、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)、Treg體外抑制實(shí)驗(yàn)。

             

            NK細(xì)胞殺傷能力鑒定

             

            NK作為自帶免疫記憶的自然殺傷細(xì)胞,對(duì)其殺傷功能的研究也是十分火熱。

             

            NK細(xì)胞主要通過以下四個(gè)途徑殺傷靶細(xì)胞:

            ①NK細(xì)胞脫顆粒,釋放穿孔素和顆粒酶殺傷靶細(xì)胞;

            ②活化的NK細(xì)胞通過釋放細(xì)胞因子來殺傷靶細(xì)胞;

            ③通過死亡受體如Fas/FasL和TNF-α/TNFR-1途徑誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡;

            ④介導(dǎo)ADCC作用殺傷靶細(xì)胞[1]。

             

            圖1 NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的四種途徑

             

            體外研究NK細(xì)胞殺傷功能主要是將NK細(xì)胞與靶細(xì)胞(通常是K562細(xì)胞)共培養(yǎng),然后通過檢測(cè)靶細(xì)胞釋放的酶或者用CAM、CFSE標(biāo)記靶細(xì)胞,通過檢測(cè)熒光,也可以通過MTT/CCK8檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量,從而得出NK細(xì)胞的殺傷活性,也可以檢測(cè)NK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子或者脫顆粒指標(biāo)CD107a。當(dāng)然我們可以換成其他的免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。

             

            小愛也給大家整理了步驟可以參考:

            1、將用熒光染料GFP,CFSE標(biāo)記的靶細(xì)胞(一般為腫瘤細(xì)胞)接種到96孔板中,不同腫瘤細(xì)胞的接種密度可以參考圖2;

             

            圖2 用于NK和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)中不同腫瘤細(xì)胞的接種密度

             

            2、第二天,將培養(yǎng)基更換成NK細(xì)胞的培養(yǎng)體系,并按照靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞(NK)1:3的比例加入NK細(xì)胞,0-12h分別進(jìn)行熒光顯微鏡拍照;

            注意:靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的共培養(yǎng)比例以及時(shí)間均需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。

             

            圖3 不同上皮細(xì)胞系在與NK共培養(yǎng)中的累積存活曲線

             

            表1 腫瘤免疫共培養(yǎng)表格


            名稱

            貨號(hào)

            應(yīng)用

            人自然殺傷細(xì)胞(NK)擴(kuò)增試劑盒

            abs9824

            NK細(xì)胞培養(yǎng)

            Recombinant Human IL-15 Protein

            abs00818

            細(xì)胞因子(國(guó)產(chǎn)高性價(jià)比)

            Recombinant Human IL-2 Protein

            abs00804




             

            混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)

             

            混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Mixed Lymphocyte Reaction, MLR)也稱作混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),是指在抗原提呈細(xì)胞刺激下,T細(xì)胞發(fā)生增殖和活化,根據(jù)淋巴細(xì)胞反應(yīng)的強(qiáng)度來評(píng)價(jià)組織相容性抗原差異和對(duì)異體細(xì)胞的反應(yīng)能力。可以分為雙向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)、單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。體外研究中,通常也會(huì)檢測(cè)T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如IFN-γ、T細(xì)胞增殖抗原CD107a。

             

            雙向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng):將來自兩個(gè)不同供體的 PBMC 共培養(yǎng),使來自兩個(gè)供體的T細(xì)胞發(fā)生雙向活化。

            單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng):將從一個(gè)供體分離的 CD4+T細(xì)胞與從另一個(gè)供體分離的DC相結(jié)合,從而使 T 細(xì)胞發(fā)生單向活化。

             

            圖4 單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體外研究示意圖

             

            小愛以單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)為例給大家介紹實(shí)驗(yàn)步驟:

            1、用50μg/mL的絲lie霉素37℃處理來自供體B的PBMCs 30min,這些細(xì)胞作為刺激細(xì)胞;

            2、300×g離心5min,去除絲lie霉素,按照2x106個(gè)PBMCs/mL(或者磁珠分選出DC細(xì)胞)接種到24孔板(250uL)中;

            3、再加入250uL來自供A的個(gè)PBMCs(2x106cells/mL)(或者磁珠分選出T細(xì)胞),作為應(yīng)答細(xì)胞;

            4、將刺激細(xì)胞和應(yīng)答細(xì)胞構(gòu)成的MLR置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)七天;

            5、7天后可以檢測(cè)應(yīng)答細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌情況。

             

            表2 腫瘤免疫共培養(yǎng)表格


            名稱

            貨號(hào)

            應(yīng)用

            人淋巴細(xì)胞分離液

            abs930

            獲得PBMCs

            CD3/CD28磁珠

            abs160019

            分選T細(xì)胞




             

            CD4+CD25+Treg和CD8+T體外抑制實(shí)驗(yàn)

             

            體外抑制實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)在于,因?yàn)橹挥蠺resp細(xì)胞(CD4+CD25-)或Treg細(xì)胞與免疫細(xì)胞共培養(yǎng),所以可以直接評(píng)估Treg細(xì)胞對(duì)CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用。除CD8+T細(xì)胞外,也可以通過改變實(shí)驗(yàn)條件來評(píng)估Treg細(xì)胞對(duì)其它免疫細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞)的影響。

             

            小愛也給大家整理了文獻(xiàn)中的實(shí)驗(yàn)步驟,可以作為參考:

             

            1、CD3/CD28磁珠的清洗:

            1)在離心管里重懸磁珠(渦旋超過30s,或者顛倒混勻5min);

            2)將確定體積的磁珠轉(zhuǎn)移到離心管中;

            3)加入等體積的PBS緩沖液含1%的HSA,或者至少1ml的體積,進(jìn)行重懸;

            4)把離心管放在磁力架(磁珠專用)上1min,隨后棄去上清;

            5)將離心管從磁力架(磁珠專用)上轉(zhuǎn)移下來,用相同體積的PBS緩沖液含1%的HSA重懸磁珠(第二步最初體積的磁珠)。

            2、取50μL CD4+CD25+Treg細(xì)胞(1×105cells/孔)。每孔加50μL CD8+T細(xì)胞作為應(yīng)答T (Tresp)細(xì)胞(1×105cells/孔)。每孔加入已經(jīng)洗過的CD3/CD28磁珠,磁珠和細(xì)胞的比例調(diào)整為1:1 。

            注意:在此步驟中,標(biāo)記和建立對(duì)照孔如下:未刺激CD8+T(不含anti-CD3/CD28);刺激的CD8+T細(xì)胞(含anti-CD3/CD28);刺激的Treg細(xì)胞(含anti-CD3/CD28)。Treg細(xì)胞可以用wan全培養(yǎng)基稀釋,以不同比例的Tresp細(xì)胞與Treg細(xì)胞(1:0.25-1:1)共培養(yǎng);

            3、各孔加50μL或適當(dāng)體積的培養(yǎng)基,總體積為200μL。用鋁箔蓋住板子,放入二氧化碳培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)72h;

            4、培養(yǎng)72h后進(jìn)行細(xì)胞因子產(chǎn)生分析,將每孔上清液分離到另一個(gè)板上,進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),檢測(cè)IFN-γ水平;

            5、將每孔上清液分離后,用FACS緩沖液清洗含有細(xì)胞的培養(yǎng)皿,4°C,300g離心2min,洗3次;

            6、洗滌后,棄去上清。用50μL的抗體緩沖液(anti-CD4、anti-CD8和細(xì)胞活力檢測(cè)試劑)重懸細(xì)胞,對(duì)增殖的CD8+T細(xì)胞進(jìn)行染色(在獲得CD8+T細(xì)胞時(shí),可使用追蹤細(xì)胞增殖的染料進(jìn)行標(biāo)記)。4°C避光孵育20min;

            7、4°C,300g離心2min,洗兩次。洗滌后,棄上清,用100μL固定緩沖液4℃避光固定20min;

            8、4°C,300g離心2min,洗兩次。200μL FACS緩沖液重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)標(biāo)記CD8+T細(xì)胞增殖情況。

             

            圖6 活化的Treg細(xì)胞抑制CD8+T細(xì)胞的增殖以及分泌IFN-γ

             


            名稱

            貨號(hào)

            應(yīng)用

            人T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基

            abs9823

            Human T細(xì)胞活化擴(kuò)增試劑盒(微米級(jí)磁珠)




             

            今天講解就到這了,大家如有細(xì)胞培養(yǎng)問題,歡迎一起交流哦!

              

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            Recombinant Human IL-2 Protein

            10ug/500ug

            abs930

            人淋巴細(xì)胞分離液

            200mL/200mL×10

            abs160019

            CD3/CD28磁珠

            1mL

            abs9823

            人T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基

            1kit




             

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