小鼠脾臟是一個重要的免疫器官，位于小鼠左側腹腔中，靠近胃的左側，呈長橢圓形狀。大小會根據小鼠的品種和健康狀況有所不同，一般來說，成年小鼠的脾臟長度大約在1.5厘米到2.5厘米之間。脾臟的顏色和質地可能會因為小鼠的品種和健康狀況而有所變化，通常呈現(xiàn)出類似葉片的形態(tài)，顏色暗紅。在實驗研究中，小鼠脾臟細胞的分離、培養(yǎng)和計數(shù)是免疫學研究的重要方法，也是流式細胞術分析的前提。
一、耗材與試劑
表1 小鼠脾臟解離部分試劑耗材參考表
材料 | 試劑 | 設備 |
15/50mL離心管 | 1xPBS緩沖液 | 水平恒溫搖床 |
10cm培養(yǎng)皿 | RPMI 1640培養(yǎng)基 | 血細胞計數(shù)板 |
眼科手術剪、眼用鑷 | 75%酒精 | 電動移液器、1mL槍頭 |
100μm細胞篩網 | FBS | 高速離心機 |
10mL移液管 | HBSS平衡液溶液 | 渦旋儀 |
5mL流式管 | Absin組織解離試劑盒 | 4℃冰箱 |
| 細胞染色緩沖液 | 流式細胞儀 |
貨號 | 產品名稱 | 規(guī)格 | 用途 |
abs50097 | 小鼠脾臟組織解離試劑盒 | 10T/25T | 解離組織 |
abs7303 | 5mL流式管(無菌無酶,帶蓋) | 500個/箱 | 流式管 |
abs9484 | RPMI1640培養(yǎng)基 | 500mL | 保存細胞活性 |
abs7232 | 70um細胞篩網 | 100個/箱 | 耗材 |
abs7102 | 15mL離心管(尖底) | 100支/袋 | 耗材 |
abs7100 | 50mL離心管(尖底) | 40支/袋 | 耗材 |
abs962 | PBS緩沖液(1x) | 500mL | 試劑 |
abs9475 | 細胞染色緩沖液 | 500mL | 試劑 |
abs9101 | 紅細胞裂解液(1x) | 100mL/500mL | 裂紅液 |
二、實驗步驟
實驗前準備：將脾臟小鼠脾臟組織解離試劑盒至于37度水浴鍋中預熱（脾臟組織解離試劑收到后，推薦分裝凍存），如果使用紅細胞裂解液為10×，需提前用超純水稀釋成1×。PBS提前預冷。
1、將小鼠頸部脫臼處死，75%酒精消毒小鼠表面，至于托盤中，左側腹部朝上，鑷子輔助操作，提起左腹側中部皮膚，剪開皮膚，肉眼可見暗紅色，長條狀脾臟，剪開腹膜，鑷子提起脾臟，見到分離，盡可能的除去結締組織和脂肪，PBS沖洗，取新鮮小鼠脾臟組織100mg-200mg左右（一個20g的小鼠，脾臟重量可能在100mg左右，具體以實際情況為準）加至50mL無菌離心管中，用眼科剪將組織che底剪碎至1-2mm3，加入小鼠脾臟組織解離試劑1mL；
2、將離心管置于恒溫搖床上，37℃/180rpm震蕩孵育30min左右，消化小鼠脾臟組織，可根據組織狀態(tài)適當調整消化時間（脾臟相對比較好消化），混懸液中肉眼無明顯組織塊時，取少量懸液倒置顯微鏡下觀察，可輔助判斷，有大量活細胞即可停止消化（中心明亮），也可用臺盼藍染色或者其他方式；
紅色圈內：死細胞 綠色圈內：活細胞
3、孵育結束后將離心管內的組織勻漿用70um無菌過濾器過濾，然后加入細胞培養(yǎng)基沖洗無菌過濾器，用50mL的離心管收集濾液；
4、將收集的濾液1200rpm離心5min ，棄上清；
5、可使用紅細胞裂解液去除組織解離過程中的紅細胞，具體操作為，向第4步所得的沉淀加入3mL 1×紅細胞裂解液，重懸沉淀，渦旋混勻，室溫下避光孵育3-5min，加入2mL預冷的PBS, 1200rpm離心 5min，棄上清。重復洗滌一次；
6、棄上清，細胞染色緩沖液重懸細胞沉淀，并調整細胞濃度至5-10×106個細胞/mL，將100uL/管的細胞懸液分配到12×75mm的流式管中，進行后續(xù)實驗。
1、細胞得率低
一般情況下，成年C57BL/6小鼠一個脾臟可解離出大約10×108–1.4×108個細胞，如果發(fā)現(xiàn)細胞得率特別低，需要注意，樣本獲取階段要盡可能完quan去除組織周圍的脂肪，盡可能將組織剪碎，從而提高細胞產量。在涉及的清洗步驟中，倒出上清液前，先用移液槍吸棄上層脂肪（可將槍頭jian端修剪一下，避免吸氣時堵塞）
2、細胞活率低，死細胞/碎片多
首先，解離試劑孵育的時間不能過長，長時間孵育會造成細胞活力降低及表面標記物丟失，死細胞過多，釋放DNA絲纏繞，導致溶液粘稠，其次，千萬不要縮短清洗的步驟，清洗可以幫助去除粘連體、碎片和死細胞，紅細胞裂解液的孵育時間也不能過長，一般5min即可，如果細胞活力還是很低，建議檢查紅細胞裂解液是否新鮮有效。
3、紅細胞裂解不wan全
表現(xiàn)為洗滌步驟后出現(xiàn)明顯的紅色沉淀。確保制備新鮮的紅細胞裂解緩沖液，在室溫下進行裂解。裂解開始前，要確保細胞已wan全重懸，裂解時間不能過短。
四、解離效果
該試劑盒講小鼠Spleen組織處理為單細胞懸液后做流式：細胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色結果
注：本產品僅作科研實驗使用，不支持臨床等研究
五、其他產品推薦
貨號 | 產品名稱 | 規(guī)格 |
abs9907 | 流式絕對計數(shù)管 | 50T |
abs9477 | 小鼠Fc受體阻斷劑 | 200T/500T |
abs9476 | 人Fc受體阻斷劑 | 50T/200T |
abs9488 | 鞘液 | 20L |
abs9107 | 佛波酯 | 1mg/5mg/25mg |
abs9108 | 離子霉素鈣鹽 | 1mg/5mg |
abs970 | D-PBS緩沖液(1×,無鈣鎂) | 500mL |
abs810012 | Brefeldin A | 10mg/25mg/50mg |
abs812975 | Monensin sodium salt | 25mg/100mg |
abs9475 | 細胞染色緩沖液 | 500mL |
abs9110 | 固定劑 | 50mL |
abs9111 | 破膜劑 | 150mL |
abs7303 | 5mL流式管(無菌無酶,帶蓋) | 1箱 |
abs1840002 | APC Mouse anti-Human CD3 Antibody(3JI3-9) | 25T/100T |
abs182427 | PE Mouse anti-Human CD4 Antibody(5D4) | 25T/100T |
abs182430 | FITC Mouse anti-Human CD8 Antibody(3C4) | 25T/100T |
abs180046 | PE-Cy7 Mouse anti-Human CD25 Antibody(BC96) | 25T/100T |
abs1840696 | FITC Mouse anti-Human CD80 Antibody(2D10.4) | 25T/100T |
abs182338 | APC Rat anti-Mouse CD25 Antibody(4APC61.5) | 25T/100T |
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Absin產品線：
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