1、目的蛋白以其他形式存在，最常見的情況
● 翻譯后修飾：如糖基化，常見接受糖基化的氨基酸是絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)和羥賴氨酸(Hydroxylysine)，例如CD2，根據(jù)uniprot顯示，其預測分子量應(yīng)該在39kda左右，但是表觀分子量一般在45kDa左右，這是由于CD2多個位點存在糖基化修飾，實際實驗中，如果想探究分子量差異是否是由糖基化引起的，可以加入糖苷酶PNGase F切去糖基后，進行WB，而除了糖基化以外，還存在磷酸化，泛素化、甲基化、乙?；榷喾N翻譯后修飾。其中，糖基化、乙?；⒓谆ǔＪ鞘贡碛^分子量變大，磷酸化通常不變或變大。
CD2理論分子量39kDa左右
表觀分子量45kDa左右
Uniprot中顯示CD2的糖基化
● 剪切：如Caspase-7存在多種形式：
1）Procaspase-7：Caspase-7的前體形式，分子量約為37kDa；
2）Intermediate caspase-7：中間形式的Caspase-7，分子量約為28kDa；
3）Caspase-7 p20：活化的Caspase-7的片段之一，分子量約為20kDa。
Procaspase-7是Caspase-7的未活化前體形式，具有較大的分子量。當細胞受到凋亡信號刺激時，procaspase通過自身切割或被其他caspase（如initiator caspases）切割激活，形成較小的活性亞單位這些亞單位結(jié)合在一起形成有活性的異二聚體。這種情況可以設(shè)置誘導組和非誘導組進行驗證。剪切后的表觀分子量會變小。
Caspase-7兔單克隆抗體的WB結(jié)果
泳道1: HeLa全細胞裂解物20ug
泳道2: Jurkat全細胞裂解物20ug
泳道3: HEK-293全細胞裂解物20ug
二抗：山羊抗兔IgG,(H+L),1/10000稀釋時綴合的HRP
預測分子量：34kDa
觀察分子量：28,35kDa
暴露時間：180s
● 多聚體和共價結(jié)合聚體：如果表觀分子量和預測分子量呈現(xiàn)倍數(shù)增長，需要考慮是否是多聚體，添加還原劑如DTT可以驗證是否為非共價結(jié)合聚體。
2、蛋白異常遷移
● 對于分子量小于20kDa的蛋白
傳統(tǒng)的Tris-Glycine體系在用于SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）時，對于小分子量蛋白質(zhì)的分離效果不佳，主要原因在于以下幾個方面：
1）離子前峰的影響：在Tris-Glycine體系中，濃縮膠通常使用pH6.8的Tris-HCl緩沖液，而電泳緩沖液和分離膠則使用pH8.3左右的Tris-Glycine緩沖液。當電泳開始時，甘氨酸(Glycine)在濃縮膠中的解離度較低，移動速度慢，形成一個移動的離子前峰。隨著電場的作用，甘氨酸逐漸解離并加速移動，在這個過程中會產(chǎn)生大量的自由十二烷基硫酸根離子(DS-)，這些離子會與小分子量蛋白結(jié)合，導致它們聚集或變性，從而影響分辨率；
2）低分子量蛋白質(zhì)的遷移問題：由于上述原因，小分子量蛋白質(zhì)在通過濃縮膠進入分離膠的過程中可能會受到阻礙，導致條帶模糊、拖尾或分辨率降低。特別是在分離小于20kDa的蛋白質(zhì)或多肽時，這種現(xiàn)象尤為明顯；
3）緩沖系統(tǒng)pH值的影響：Tris-Glycine系統(tǒng)的pH值較高，這可能導致小分子量蛋白質(zhì)在電泳過程中的某些修飾或降解，進一步影響其分離效果。
因此推薦使用Tricine-SDS-PAGE體系對20kDa以下的小分子量蛋白質(zhì)或多肽進行分離。Tricine作為電泳緩沖液成分之一，其pKa值較低(8.15)，使得它在電泳過程中不會像甘氨酸那樣產(chǎn)生大量的游離DS-離子，從而減少了對小分子量蛋白質(zhì)的影響，并且能夠提供更高的分辨率。此外，Tricine-SDS-PAGE通常采用較低濃度的丙烯酰胺凝膠，以適應(yīng)小分子量蛋白質(zhì)的分離需求。
● 蛋白電荷或特殊結(jié)構(gòu)如氨基酸側(cè)鏈的特殊排列方式，電泳時存在遷移過快或過慢的現(xiàn)象。
3、蛋白marker的問題
和非預染marker相比，預染marker雖然使用更加方便，但是由于偶聯(lián)了染料，也存在分子量偏移的現(xiàn)象，并且同一個marker在不同的電泳體系中，遷移速度也會有所偏差。
abs923預染蛋白Marker(10-245kDa)
4、樣本制備問題
● 膜蛋白95度加熱變性會引起聚集，導致檢測條帶表觀分子量增大；
● 樣本變性或還原不che底會影響抗原表位暴露，進而影響其遷移速率，樣本制備時一定要保證上樣緩沖液足量、在保質(zhì)期內(nèi)、并且要選對裂解液，看清具體成分；
● 樣本一定要新鮮，有些蛋白極易發(fā)生降解，制備時要注意。
5、排除以上問題，最重要的就是要充分了解自己的樣本是否表達目的蛋白，以及表達豐度如何，并且查詢廠家的驗證圖，了解抗體的特異性如何。
WB終于有跡可循了?。。?/span>
Wb好物推薦
類別 | 貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
樣本處理 | abs9229 | RIPA裂解液(強) | 100mL |
abs9116 | 免疫印跡及免疫沉淀用(WB/IP)裂解液 | 100mL | |
abs9161 | 廣譜型蛋白酶抑制劑混合物(不含EDTA,100×DMSO儲液) | 1mL | |
abs9162 | 廣譜型磷酸酶抑制劑混合物(100×儲液) | 1mL | |
蛋白定量 | abs9232 | BCA蛋白定量試劑盒 | 500T |
上樣 | abs953 | 上樣緩沖液(2×) | 10mL |
abs9829 | 上樣緩沖液(5×) | 10mL | |
Marker | abs924 | 預染蛋白Marker(10-180kDa) | 250uL |
abs923 | 預染蛋白Marker(10-245kDa) | 500uL | |
abs90004 | 預染發(fā)光Western Marker | 500uL | |
電泳 | abs951 | 電泳液(10×) | 1L |
abs9359 | Tris-Glycine-SDS電泳緩沖液(10×) | 500mL | |
預制膠 | Plastic gel、Glass gel等多款預制膠 | ||
凝膠試劑盒 | abs9367 | 彩色PAGE快速凝膠試劑盒(10%) | 1kit |
abs9368 | 彩色PAGE快速凝膠試劑盒(12%) | 1kit | |
abs9366 | 彩色PAGE快速凝膠試劑盒(8%) | 1kit | |
轉(zhuǎn)膜 | abs932 | PVDF膜(0.45μm) | 1卷 |
abs931 | PVDF膜(0.22μm) | 1卷 | |
abs960 | NC膜(0.45μm) | 1卷 | |
abs959 | NC膜(0.22μm) | 1卷 | |
abs950 | 電轉(zhuǎn)液(10×) | 100mL | |
封閉 | abs9175 | 脫脂奶粉 | 500g |
abs9915 | Western Blot快速封閉液 | 500mL | |
一抗孵育 | abs954 | WB專用一抗二抗稀釋液 | 100mL |
WB一抗(3萬余產(chǎn)品,多指標覆蓋) | |||
內(nèi)參抗體 | abs132001 | Rabbit anti-β-Actin Polyclonal Antibody | 100ug |
abs830030 | Mouse anti-GAPDH Monoclonal Antibody | 1mL | |
abs830032 | Mouse anti-β-Tubulin Monoclonal Antibody | 1mL | |
二抗 | abs20040 | Goat anti-Rabbit IgG-HRP Antibody | 500uL |
abs20001 | Goat anti-Mouse IgG-HRP Antibody | 1mL | |
顯色 | abs9213 | DAB顯色試劑盒(紫藍色,WB) | 1kit |
abs920 | ECL化學發(fā)光檢測試劑盒 | 25mL×2 | |
abs9434 | 超敏型ECL化學發(fā)光檢測試劑盒 | 25mL×2 | |
abs9435 | 極敏型ECL化學發(fā)光檢測試劑盒 | 25mL×2 | |
Absin產(chǎn)品線：
爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測、殘留檢測、多因子檢測)；細胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...
特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...
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