1、實驗前準備
試劑準備
40% Percoll溶液配制：
Percoll細胞分離液與PBS緩沖液(10×)按體積比9:1混合，配制等滲100% Percoll母液。用100% Percoll母液和RPMI 1640/1×PBS按體積比4:6混合，配制40%等滲Percoll溶液。
80% Percoll溶液：
Percoll細胞分離液與PBS緩沖液(10×)按體積比9:1混合，配制等滲100% Percoll母液。用100% Percoll母液和RPMI 1640/1×PBS按體積比8:2混合，配制80%等滲Percoll溶液。
2、腸道固有層免疫細胞分離步驟操作步驟
1）頸椎脫臼法處死小鼠并固定在手術(shù)臺上，75%酒精消毒小鼠腹部，于正中縱行剪開暴露腹腔；
2）如下圖所示，在小鼠胃與十二指腸連接處剪斷，一邊分離小腸周圍脂肪組織和腸系膜，一邊拉出小腸，之后在小腸和盲腸連接處剪斷，從而分離出小腸。
小鼠腸道組織解剖圖
3）10cm培養(yǎng)皿中加入5mL 4°C預(yù)冷的PBS，將步驟2中的小腸放入培養(yǎng)皿潤洗，使用鑷子和剪刀依次去除脂肪組織和派伊爾結(jié)。
小鼠派伊爾結(jié)去除操作圖
A. 去除表面脂肪和腸系膜等組織的小腸，紅色箭頭指示派氏結(jié)（平均每只小鼠有6-9個派氏結(jié)）；
B. 剪去派氏結(jié)的操作示意圖；
C. 去除派氏結(jié)后的小腸，紅框是所有剪下來的所有派氏結(jié)。
小鼠派伊爾結(jié)(Peyer's patches, PPs)是小鼠腸道黏膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分，主要分布在小鼠小腸的下部，即遠端空腸和回腸，與小鼠固有層免疫細胞的組成和功能有顯著差異，在分離小鼠腸道免疫細胞時，去除派伊爾結(jié)是為了確保獲得更純凈、更具代表性的目標細胞群體，從而提高實驗結(jié)果的可靠性。
4）將小腸切成4段，用剪刀縱向剪開小腸（不必沿著腸系膜方向），暴露出腸內(nèi)容物，輕輕地將腸內(nèi)容物從粘膜表面刮除；
5）將小腸轉(zhuǎn)移到含有10mL HBSS + 2%FBS的50mL離心管中，劇烈渦旋10-20s；
6）用鑷子取出小腸重復(fù)清洗2次；
7）將清洗過的腸組織，剪碎成0.5cm的小片段，將組織塊(100-200mg)轉(zhuǎn)移到2mL圓底管中，加入1mL小鼠腸道組織解離液(abs50093)，37°C水平搖床輕輕搖晃孵育60min（根據(jù)組織糜爛狀態(tài)適當延長孵育時間）；
8）從水平搖床中取出圓底管，劇烈渦旋10-20s，通過70μm細胞篩網(wǎng)(abs7232)過濾，用10mL PBS沖洗細胞篩網(wǎng)；
9）收集含有細胞的濾液到50mL管中，20°C下400g離心5min，棄上清液，用 4 mL 40% percoll（abs9102）重懸細胞沉淀并轉(zhuǎn)移到 15 mL 離心管；
10）吸取 2.5 mL 80% percoll 深入到 15 mL 離心管底部，試管稍微傾斜，將 4 mL 40% percoll 與細胞的混合液沿著管壁緩慢加入離心管，覆蓋在 80% percoll 溶液的頂部形成密度梯度；
▲ 注意：不要破壞 80% percoll 和 40% percoll 與細胞的懸浮液的分界面，40% 和 80% percoll 現(xiàn)配現(xiàn)用。
11）800 g 20 °C 離心 20 min，升速（ACC）1，降速（DEC）1；
Percoll 分離組織免疫細胞示意圖
注：分離圖片參考自文獻 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010327
12）離心結(jié)束后，吸取中間白膜層免疫細胞至新的 15 mL 離心管中，加入 3 倍體積 4°C 預(yù)冷 PBS，上下顛倒混勻，4 °C 下 400 g 離心 5 min，棄上清；
13）按照步驟 12 重復(fù)清洗一次，棄上清得到腸道固有層淋巴細胞；
14）細胞染色緩沖液（abs9475）重懸細胞沉淀，并調(diào)整細胞濃度至 5-10×106 cells/mL，將 100 μL/管的細胞懸液分配到 12×75 mm 的流式管（abs7303）中用于后續(xù)實驗操作。
3、流式實驗結(jié)果圖
4、相關(guān)產(chǎn)品推薦
貨號 | 品名 | 規(guī)格 | 用途 |
abs9474 | 組織保存液 | 100mL | 保存組織 |
abs50093 | 小鼠腸道組織解離試劑盒 | 25T | 消化組織酶 |
abs9102 | 細胞分離液 | 100mL | 富集細胞 |
abs7232 | 70um 細胞篩網(wǎng) | 100 個 | 篩網(wǎng) |
abs7303 | 5mL 流式管（無菌無酶，帶帽） | 500 個 | 流式管 |
abs9475 | 細胞染色緩沖液 | 500mL | 染色緩沖液 |
更多流式好物推薦
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
abs9907 | 流式絕對計數(shù)管 | 50T |
abs9477 | 小鼠 Fc 受體阻斷劑 | 200T/500T |
abs9476 | 人 Fc 受體阻斷劑 | 50T/200T |
abs9488 | 鞘液 | 20L |
abs9107 | 佛波酯 | 1mg/5mg/25mg |
abs9108 | 離子霉素鈣鹽 | 1mg/5mg |
abs970 | D-PBS緩沖液（1×，無鈣鎂） | 500mL |
abs810012 | Brefeldin A | 10mg/25mg/50mg |
abs812975 | Monensin sodium salt | 25mg/100mg |
abs9110 | 固定劑 | 50mL |
abs9111 | 破膜劑 | 150mL |
abs7303 | 5mL流式管（無菌無酶，帶蓋） | 1箱 |
abs1840002 | APC Mouse anti-Human CD3 Antibody(3JI3-9) | 25T/100T |
abs182427 | PE Mouse anti-Human CD4 Antibody(5D4) | 25T/100T |
abs182430 | FITC Mouse anti-Human CD8 Antibody(3C4) | 25T/100T |
abs180046 | PE-Cy7 Mouse anti-Human CD25 Antibody(BC96) | 25T/100T |
abs1840696 | FITC Mouse anti-Human CD80 Antibody(2D10.4) | 25T/100T |
abs182338 | APC Rat anti-Mouse CD25 Antibody(4APC61.5) | 25T/100T |
More...... | ||
Absin產(chǎn)品線：
爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測、殘留檢測、多因子檢測)；細胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...
特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...
9
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務(wù)