IPS誘導(dǎo)腸類器官培養(yǎng)分為三大階段：人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)、內(nèi)胚層分化及中/后腸模式化誘導(dǎo)、類器官培養(yǎng)。
內(nèi)胚層分化及中/后腸模式化誘導(dǎo)
一、前期準(zhǔn)備
1、試劑與設(shè)備
- 細(xì)胞：H1/H9 hESC或患者來源iPSCs。
- 培養(yǎng)基：人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基(abs9403)、RPMI 1640(abs9484)。
- 消化液：人多能干細(xì)胞消化液(abs9409)
- 培養(yǎng)基添加劑：L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(2mM)(abs9295)、雙抗(abs9244)
- 生長因子：Activin A(100ng/mL)(abs05801)、FGF4(500ng/mL)(abs06269)、WNT3a(500ng/mL)(abs05632)。
- 基質(zhì)膠：即用型基質(zhì)膠（培養(yǎng)板包被）(abs9410)、類器官專用基質(zhì)膠(abs9495)。
- 血清：透析胎牛血清(abs945)
- 關(guān)鍵設(shè)備：表面培養(yǎng)皿、立體顯微鏡、無菌手術(shù)刀、預(yù)冷微量離心管。
2、試劑配制
- 內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基：
- Day1：RPMI 1640+L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(2mM)+雙抗(1%)+Activin A(100ng/mL)。
- Day2：Day1配方+透析胎牛血清(0.2%)。
- Day3：Day1配方+透析胎牛血清(2%)。
- 中/后腸分化培養(yǎng)基：
-RPMI 1640+透析胎牛血清(2%)+FGF4(500ng/mL)+WNT3a(500ng/mL)。
二、hPSCs傳代與鋪板
1、細(xì)胞傳代（耗時(shí)2h）
- 使用人多能干細(xì)胞消化液消化hPSCs至邊緣卷起。
- 用細(xì)胞刮刀輕柔剝離細(xì)胞團(tuán)，反復(fù)吹打至1-2mm大小細(xì)胞團(tuán)。
- 按1:6比例接種至Matrigel包被的24孔板（每孔約5000個(gè)細(xì)胞團(tuán)）。
- 輕敲培養(yǎng)板使細(xì)胞均勻分布，37°C過夜培養(yǎng)。
2、細(xì)胞擴(kuò)增至85-90%融合（3-4天）
- 每日更換人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞密度。
- 關(guān)鍵：密度過高（自發(fā)分化）或過低（分化效率低）需重新鋪板。
三、內(nèi)胚層分化（3天）
1、Day1：吸除人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，加入Day1內(nèi)胚層培養(yǎng)基（無血清），培養(yǎng)24h。
2、Day2：更換為Day2內(nèi)胚層培養(yǎng)基（含0.2%透析胎牛血清），培養(yǎng)24h。
3、Day3：更換為Day3內(nèi)胚層培養(yǎng)基（含2%透析胎牛血清），培養(yǎng)24h。
4、驗(yàn)證分化效率（可選）：
- 免疫染色檢測FOXA2/SOX17雙陽性細(xì)胞（效率應(yīng)達(dá)85-90%）。
四、中/后腸模式化（3-4天）
1、誘導(dǎo)球狀體形成
-吸除內(nèi)胚層培養(yǎng)基，加入中/后腸分化培養(yǎng)基，每日更換。
-48h后：立體顯微鏡下觀察上皮增厚，72-96h球狀體(spheroids)脫離單層細(xì)胞。
2、收集球狀體
-用200μL槍頭收集游離球狀體，每管約50個(gè)，置于冰上備用。
本期小愛推薦
貨號(hào) | 品名 | 規(guī)格 |
abs9403 | 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基 | 500ml |
abs9409 | 人多能干細(xì)胞消化液 | 100mL |
abs9295 | L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（100×，200mM） | 100mL |
abs9412 | ES/iPS細(xì)胞凍存液 | 100mL |
abs9410 | 即用型基質(zhì)膠 | 100mL |
abs9484 | RPMI 1640 | 500mL |
abs9244 | 雙抗 | 100mL |
abs05801 | Activin A | 10ug |
abs06269 | FGF4 | 50ug |
abs05632 | WNT3a | 50ug |
abs9495 | 基質(zhì)膠（低因子、無酚紅） | 1.5ml*8 |
abs945 | 透析胎牛血清 | 500mL |
abs9545 | 人正常腸類器官培養(yǎng)試劑盒 | 1kit |
abs7289 | 2mL低溫金屬冰盒（24孔，平底） | 1個(gè) |
abs7033 | 細(xì)胞培養(yǎng)板（標(biāo)準(zhǔn)透明6孔板） | 50個(gè)/箱 |
abs7035 | 細(xì)胞培養(yǎng)板（標(biāo)準(zhǔn)透明24孔板） | 1箱 |
abs7164 | 細(xì)胞凍存管 | 1箱 |
abs7053 | 10mL一次性移液管 | 1箱 |
abs7054 | 25mL一次性移液管 | 1箱 |
Absin產(chǎn)品線：
爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測、殘留檢測、多因子檢測)；細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...
特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...
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