背景介紹
裸露的RNA是帶負電荷的親水性大分子，因為細胞膜的靜電排斥，難以進入細胞，且易被無處不在的RNA酶快速降解，所以需要保護性外殼才能進入細胞。細胞膜的組成主要是脂質，利用脂質囊泡包封RNA穿過細胞膜并將RNA釋放到細胞質中。囊泡應該是一種帶正電的脂質，才能夠結合帶負電的RNA。
然而，由永jiu性陽離子脂質組成的囊泡由于能與帶負電的細胞膜發(fā)生靜電作用而引起細胞毒性，脂質結構才能夠對內體酸性環(huán)境響應而帶正電荷的分子。
脂質納米粒結構
LNP通常由四種關鍵成分組成：可離子化的陽離子脂質、磷脂（兩性離子脂質）(PL)、膽固醇和PEG化脂質。
脂質納米粒遞送機制
脂質納米粒(LNP)作為mRNA的傳遞系統(tǒng)，其作用機制涉及多個步驟，確保mRNA安全有效地遞送到目標細胞并表達蛋白。在LNP中，可電離的陽離子脂質發(fā)揮著重要作用，因為它可以帶正電荷低于其Ka以介導在自組裝成LNP期間負載帶負電荷的RNA，在中性pH下不帶電以最大限度地減少毒性，并在細胞吸收后再次帶正電荷以促進內體逃逸隨著內體pH降低。膽固醇和PEG脂質的變體已被證明可以調節(jié)LNP物理性質、納米結構和最終功效。兩性離子磷脂通常被稱為“輔助脂質"。LNPs在保護mRNA、促進細胞內傳遞、以及激活免疫反應方面發(fā)揮關鍵作用。
LNP轉染實驗步驟
下述轉染步驟中為6孔板單孔參考條件。對于其他培養(yǎng)形式，請參考表1。
1、mRNA 預混液制備
將2.5ug mRNA（濃度為1ug/uL）與60uL Buffer混合。
2、mRNA-easyLNP復合物
將62.5uL mRNA預混液與62.5uL easyLNP納米混懸液混合，渦旋2-3s，混勻。
3、加入細胞
將125uL mRNA-easyLNP復合物加入細胞，輕輕晃動使均勻分散。
4、分析時間
培養(yǎng)24-48h后分析。
表1 根據(jù)每孔使用的細胞培養(yǎng)容器的mRNA轉染指南
mRNA細胞轉染步驟 | 試劑 | 96孔板 | 24孔板 | 6孔板 |
（1）40ng/μL mRNA預混液制備 | Buffer(以mRNA原液濃度1μg/μL為例) | 2.4μL | 12μL | 60μL |
mRNA | 0.1μg | 0.5μg | 2.5μg | |
（2）mRNA-easyLNP復合物制備 | easyLNP納米混懸液 | 2.5μL | 12.5μL | 62.5μL |
mRNA預混液 | 2.5μL | 12.5μL | 62.5μL | |
（3）加入細胞 | mRNA-easyLNP復合物 | 5μL | 25μL | 125μL |
實驗示意圖：
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轉染方式 | 貨號 | 品名 | 規(guī)格 |
細胞 | abs60339 | mRNA轉染試劑 | 1mL |
abs60620 | easyLNP™ mRNA免疫細胞轉染試劑盒 | 1.5mL/3mL/5mL | |
abs60621 | easyLNP™ Plus通用型RNA細胞轉染試劑盒 | 1.5mL/3mL/5mL | |
abs60322 | Lipofect5000質粒轉染試劑 | 0.5mL/1.0mL | |
abs60255 | 質粒DNA轉染試劑盒(貼壁細胞) | 0.5mL/1.0mL/1.5mL | |
abs60256 | PM原代細胞質粒DNA轉染試劑盒 | 0.1mL/0.5mL/1.0mL/1.5mL | |
abs60327 | SP懸浮細胞質粒DNA轉染試劑盒 | 0.1mL/0.5mL/1.0mL/1.5mL | |
abs60369 | RF 293細胞DNA轉染試劑盒 | 0.5mL/1.5mL | |
abs60259 | 核酸轉染試劑盒 | 0.5mL/1.0mL/1.5mL | |
abs60324 | PM原代細胞核酸轉染試劑盒 | 0.5mL/1.0mL/1.5mL | |
abs60325 | SP懸浮細胞核酸轉染試劑盒 | 0.5mL/1.0mL/1.5mL | |
abs60252 | 小核酸轉染試劑 | 0.5mL/1.0mL/1.5mL | |
abs60253 | PM原代細胞小核酸轉染試劑 | 0.1mL/0.5mL/1.0mL/1.5mL | |
abs60254 | SP懸浮細胞小核酸轉染試劑 | 0.1mL/0.5mL/1.0mL/1.5mL | |
abs60317 | 核酸共轉染試劑 | 0.5mL/1.0mL/1.5mL | |
abs7993 | 50nm磁轉染試劑 | 100uL | |
轉染增強劑 | abs42025397 | 聚凝胺溶液 | 1mL |
abs42085824 | 海美溴銨 | 5g | |
abs42085198 | 魚精蛋白硫酸鹽 | 5g/25g | |
動物體內 | abs60622 | easyLNP™ mRNA體內轉染試劑盒(全身作用) | 0.3mL/0.5mL/1mL |
abs60623 | easyLNP™ mRNA體內轉染試劑盒(局部作用) | 0.3mL/0.5mL/1mL | |
核酸轉染(動物體內) | abs60258 | Elite Fect-I小核酸活體組織轉染試劑(小鼠轉染) | 3只/6只 |
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