簡介

近年來，在開發(fā)腫瘤細胞體外聚集體以用作體內(nèi)組織環(huán)境模型方面取得了顯著進展。當(dāng)接種至超低黏附圓底微孔板的一個孔中時，這些聚集體會形成一個離散的細胞球。細胞球被認為可比常規(guī)二維 (2D) 細胞培養(yǎng)更有效地模擬腫瘤行為，因為它們與腫瘤非常相似，同時包含表面暴露和深埋的細胞、增殖和非增殖細胞，并包含具有一個充分氧化的細胞外層和缺氧中心。此類 3D 細胞球模型已成功用于環(huán)境篩選以鑒定潛在癌癥治療方法。開發(fā)可靠細胞球檢測的一些挑戰(zhàn)：

• 定位并聚焦于每個孔中的細胞球，以便在單個視野中對其進行成像

•  優(yōu)化化合物和染色處理，以確保染料滲透并避免干擾細胞球的放置

• 在整個3D 結(jié)構(gòu)中采集代表性圖像，盡可能減少成像平面上方和下方的離焦或背景信號

•  快速分析圖像以產(chǎn)生有意義的結(jié)果，從而得出結(jié)論

優(yōu)勢

•  以20x 放大倍率在一個視野中捕獲整個細胞球

•  以96 孔或384孔形式篩選生物相關(guān)的 3D 細胞球

•  使用共聚焦成像精確檢測細胞應(yīng)答

• 通過僅保存Z平面圖像的2D重構(gòu)來節(jié)省存儲空間

細胞球形成和處理

我們使用以下方法從癌細胞系 HCT116, DU145 和 HepG2 中形成細胞球。將細胞在 37°C 和 5% CO2 的燒瓶中培養(yǎng)，然后分離并接種到 96 或 384 孔黑色板中，孔底為透明底部 U 形孔（分別為 Corning 4520 和 3830），密度為 1000-1500 個細胞/孔，在適當(dāng)培養(yǎng)基中補充胎牛血清 （FBS）。在 24 小時內(nèi)，每個孔底部形成單個細胞球，并在 37°C 和 5% CO2 條件下 繼續(xù)生長2-4 天，直至用于實驗（圖 1）。細胞球的培養(yǎng)時間可能更長，但大小的增加可能會阻礙染色滲透和中心大多數(shù)細胞的成像。本應(yīng)用說明描述了用于確定抗癌化合物作用的測定方法：依托泊苷、紫杉醇和絲裂霉素 C。細胞球處理首先將 10 倍濃度的化合物添加到孔中，然后孵育 1-4 天，具體取決于正在研究的機制。較短的時間用于研究細胞凋亡，較長的時間用于多參數(shù)細胞毒性研究。對于超過 2 天的藥物治療，化合物每 2 天以 1 倍濃度更新一次。 

細胞球染色和成像

此處顯示的示例來自開發(fā) HCT116 細胞球測定法，用于評估除孔中凋亡細胞發(fā)生率外的細胞球形態(tài)變化。化合物處理完成后，將染色劑以 4-6 倍濃度合并成單一混合物，并直接添加到孔中的培養(yǎng)基中。選擇免洗染色劑以避免干擾細胞球。

使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)以 10X或 20X的放大倍率觀察細胞球。為了分析整個 3D 結(jié)構(gòu)中的細胞應(yīng)答，從細胞球體內(nèi)的不同深度收集圖像，以創(chuàng)建圖像的“堆棧”。然后使用數(shù)學(xué)算法將該圖像堆棧組合或“折疊”成單個 2D 投影圖像。在這種情況下，使用 MetaXpress 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件的最大投影算法生成折疊圖像，該算法可使堆疊中的像素保持最亮的強度以生成投影（圖 2）。

ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)可生成更清晰的圖像，以實現(xiàn)更準(zhǔn)確的分割

共聚焦光學(xué)器件能夠?qū)Ρ葘拡龉鈱W(xué)器件更薄的細胞球光學(xué)切片進行成像。這可顯著減少被采集平面上方和下方的熒光發(fā)射物體產(chǎn)生的背景模糊。它還允許在亞細胞層面或在彼此聚集或堆疊的細胞之間更好地解析精細細節(jié)，因為它們處于 3D 結(jié)構(gòu)中。使用共聚焦圖像通?？蓪崿F(xiàn)更準(zhǔn)確的分割。在使用細胞球的重復(fù)實驗中，寬場圖像的細胞核分割比共聚焦圖像中計數(shù)的細胞核低約 20%（圖 3）。

圖 1：在高通量篩選環(huán)境中檢測細胞球的工作流程 單個細胞球可在 96 或 384 孔板中生長，用化合物處理，并用免洗即可成像的染料混合物染色。若需要，還可以固定細胞球。（右）使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)上的延時采集在 63 小時內(nèi)拍攝 HCT116 細胞的透射光圖像，以顯示細胞球的形成（10 倍物鏡）。

圖 2.  在橫跨細胞球深度約一半的 z 平面中采集共聚焦圖像堆疊（左）。在任何給定平面上，只有細胞球的某些細胞處于焦點中，因此，為了便于分析，圖像被折疊成單個 2D 圖像，以組合焦點內(nèi)區(qū)域（右）。

使用凋亡檢測篩選抗癌藥物

一類抗癌藥物靶向細胞凋亡的外在途徑，以觸發(fā)細胞死亡。為了展示細胞凋亡的測定，用 4 種不同抗癌化合物的系列稀釋處理在 96 孔板中培養(yǎng) 3 天的 HCT116 細胞球 24-48 小時。化合物處理完成后，使用 Life Technologies 的 CellEvent Caspase 和 MitoTracker Orange 試劑檢測細胞凋亡。將包括 Hoechst 核染料在內(nèi)的 4 倍混合染料添加到孔中的培養(yǎng)基中。選擇免洗染料以避免干擾細胞球（圖 4）。 

圖 3.  （頂部）使用寬場光學(xué)器件拍攝的 HCT116 細胞球的 15 張圖像的Best focus投影。軟件分割計數(shù) 817 個細胞核。 

由于細胞球邊緣的失焦熒光和中心檢測不佳的較暗的細胞導(dǎo)致失真，因此細胞核被遺漏。（底部）使用共聚焦光學(xué)器件拍攝的 HCT116 細胞球的 15 張圖像的Best focus投影。計數(shù)更加準(zhǔn)確，共1078 個細胞核。

用于多參數(shù)凋亡檢測

的染色劑                目的              最終濃度

圖 4.  （頂部）用化合物處理的 96 孔板中 HCT116 細胞球的圖像縮略圖的蒙太奇，以 10X Plan Fluor 物鏡成像。Hoechst 染色的細胞核（藍色）被 CellEvent Caspase 3/7 凋亡標(biāo)記物（綠色）覆蓋。未處理的對照在第 4 列，Caspase 3/7 應(yīng)答在第 5-7 列明顯，其中紫杉醇在A 行從 1 μM 按 1：3 的比例連續(xù)稀釋（3個交叉重復(fù)）。（左）將十一個 z 平面合并為 2D 最大投影圖像，并使用簡單的自定義模塊進行分析。原始圖像展示了低水平和高水平的細胞凋亡及其相應(yīng)的分割掩膜（寶藍 = 胞核，粉色 = 凋亡細胞）。（右）通過標(biāo)準(zhǔn)化細胞凋亡量與未處理的細胞球相比并繪制圖表，可以看出紫杉醇（綠線）在比絲裂霉素 C 或依托泊苷低得多的濃度下誘導(dǎo)了細胞凋亡。

圖 5.  抗霉素A 對線粒體的毒性作用。（左圖）Hoechst（藍色）和 MitoTracker（橙色）細胞球的疊加圖像，經(jīng) 1、22、67 和 200 nM 濃度遞增的抗霉素 A 處理。（右）細胞球內(nèi)識別的線粒體平均強度值圖說明了藥物的作用。

在篩選中對線粒體膜電位進行多重檢測

在上面的凋亡篩選中，線粒體膜電位也可以通過將 MitoTracker Orange 添加到染料混合物中來評估?；蛘撸梢詥为氀芯客ㄟ^影響線粒體代謝來抑制腫瘤生長的藥物。下文展示了使用抗霉素 A 進行的測定，抗霉素 A 是線粒體膜電位的一種有效干擾物。經(jīng)過 4 小時處理后，根據(jù)細胞球內(nèi) MitoTracker Orange 的強度可檢測到線粒體健康。MitoTracker 要么沒有全部穿透到大細胞球的中心，要么中央的細胞沒有健康的線粒體，正如圖像中線粒體波長通常呈調(diào)暗的內(nèi)部所指出的那樣（圖 5）。

迅速篩選微孔板中的3D細胞球

體內(nèi) 3D 培養(yǎng)系統(tǒng)能夠產(chǎn)生大小一致的人癌細胞球，并且能夠使用自動化高通量、高內(nèi)涵成像篩選細胞球?qū)χ委煹姆磻?yīng)，這是促進化療候選藥物進行更相關(guān)檢測的重要步驟。ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)和 MetaXpress 軟件可對微孔板中的 3D 細胞球進行快速成像和分析，以監(jiān)測抗癌藥物誘導(dǎo)的凋亡和線粒體毒性。

有關(guān)優(yōu)化這些細胞球篩選檢測的采集參數(shù)的更多信息，請參閱論文：

Sirenko, O. et al., High-Content Assays

for Characterizing the Viability and Morphology of 3D

Cancer Spheroid Cultures. Assay and Drug Development

Technologies, 2015 In Press.