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詳細介紹
胼胝質含量測試盒熒光法
本公司所有產品僅供科學實驗，不做其他科學實驗外的使用！
商品屬性：
貨號 | GOY-SH265熒光法 | 檢測方法 | 熒光法 |
規(guī)格 | 100管/96樣 | 產品類別 | 其它系列 |
測定意義：
胼胝質（callose）是圍繞每個篩孔的邊緣積累的碳水化合物，是一種以β-1,3鍵結合的葡聚糖，在植物的篩管代謝、配子體發(fā)育等生命活動中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用，其合成、分解直接關系植物正常的生長代謝過程。
測定原理：
胼胝質與苯胺藍染料反應，產生熒光物質，在激發(fā)波長400nm，發(fā)射波長500nm下熒光強度。
自備儀器和用品：
研缽、冰、低溫離心機、熒光酶標儀、黑色96孔板、可調式移液器、乙醇和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液一：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。
提取液二：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：液體 20mL×1 瓶，4℃保存；
試劑三：液體 14uL×1 支，4℃保存；
組織樣本的前處
①總 GAPDH 酶提?。航ㄗh稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測定。
②胞漿和葉綠體 GAPDH 酶的分離：按照植物組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5～10的比例（建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液一），冰浴勻漿后于 4℃，200g 離心 5min，棄沉淀，取上清4℃，8000g 離心 10min，取上清用于測定胞漿 GAPDH 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取清測定葉綠體中 GAPDH 酶活性。建議測定總 GAPDH 酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的GAPDH，則按照步驟②提取粗酶液。細菌或培養(yǎng)細胞的前處理先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
測定步驟:
1、 分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調零。
2、 樣本測定
（1）工作液的配制：將試劑二全部倒入試劑一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)預熱 10 分鐘；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
（2）在試劑三中加入 500μL 蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
（3）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 5μL 樣本、5μL 試劑三和 190μL 工作液，混勻，加入最后一個試劑的同時開始計時，記錄 340nm 處 20s 時的吸光值 A1 和 5min20s 后的吸光值 A2，計算 ΔA=A1-A2。
GAPDH 活性計算
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。GAPDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=1286×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每一萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。GAPDH（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500 ×V 樣÷V 樣總) ÷T=2.572×ΔA
V 反總：反應體系總體積，2×10-4L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.005 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。
b.用 96 孔板測定的計算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=2572×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。GAPDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=2572×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每一萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。GAPDH（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500 ×V 樣÷V 樣總) ÷T=5.144×ΔA
V 反總：反應體系總體積，2×10-4L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.005 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。
生化試劑盒的使用注意事項：
選擇合適的試劑盒：根據(jù)實驗目的和檢測對象選擇合適的試劑盒，確保實驗的準確性和可靠性。
嚴格遵循說明書：按照試劑盒的說明書進行操作，避免誤用或浪費。
注意保存條件：按照試劑盒的保存條件進行妥善保存，避免陽光直射、高溫或潮濕等不利因素。
控制實驗條件：在實驗過程中嚴格控制實驗條件，如溫度、時間、pH值等，以確保實驗結果的穩(wěn)定性。
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