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qPCR實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法
PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction）的簡(jiǎn)稱，是一種選擇性體外快速擴(kuò)增DNA片段的方法。在體外以類似于細(xì)胞內(nèi)DNA的半保留復(fù)制過(guò)程，以擬擴(kuò)增的模板DNA分子，與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4種dNTP及適合的緩沖體系組成的反應(yīng)體系，經(jīng)過(guò)重復(fù)地變性一退火一延伸三步，擴(kuò)增新的目的DNA鏈，這個(gè)過(guò)程通過(guò)控制反應(yīng)體系的溫度來(lái)實(shí)現(xiàn)?？梢栽诙虝r(shí)間內(nèi)將微量的DNA片段擴(kuò)增到足夠數(shù)量，用于后續(xù)的研究和檢測(cè)。下面讓我們一起來(lái)看看qPCR實(shí)驗(yàn)的常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法吧！
一、擴(kuò)增曲線不穩(wěn)定
可能原因
RNA純度低；體系中存在較多雜質(zhì)；儀器使用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
解決方案
1）提取高純度的RNA，小心操作。
2）對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。
二、擴(kuò)增無(wú)法達(dá)到平臺(tái)期
可能原因
模板濃度太低；循環(huán)數(shù)太少；試劑擴(kuò)增效率低。
解決方案
1) 提高模板量
2) 提高循環(huán)數(shù)
3) 用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定擴(kuò)增效率，提高鎂離子濃度，換用擴(kuò)增效率高的試劑。
三、熒光下降
可能原因
存在降解；模板濃度過(guò)高。
解決方案
1) 提高體系純度
2) 降低模板量
3) 降低熒光閾值
四、單峰、峰不尖銳
可能原因
與試劑成分有關(guān)；或存在大小相近的非特異性擴(kuò)增。
解決方案
1) 溫度跨度不高于7度，視為可用結(jié)果
2) 進(jìn)行高濃度瓊脂糖電泳，確認(rèn)是否為單一條帶。
五、單峰，Tm低于80度
可能原因
只有引物二聚體，無(wú)目的條帶；或擴(kuò)增片段過(guò)短。
解決方案
1) 檢查是否加入模板
2) 進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，確定條帶大小是否正確
六、雙峰，較低峰Tm在80度之前
可能原因
由于模板濃度過(guò)低或引物濃度過(guò)高使多余引物形成引物二聚體。
解決方案
1) 適當(dāng)提高退火溫度
2) 提高模板量，降低引物濃度
3) 重新設(shè)計(jì)引物。
七、qPCR注意事項(xiàng)
·提高樣品純度，盡量減少樣品之間的交叉污染。
·每個(gè)樣品至少要做3個(gè)平行孔，以防在 后面的數(shù)據(jù)分析中，由于Ct相差較多或者SD太大，無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
·MasterMix不要反復(fù)凍融，如果經(jīng)常使用，最好融解后放 在4℃；配置體系時(shí)在冰上操作；減少加樣誤差，每管或每孔都要換新槍頭，不要連續(xù)用同一個(gè)槍頭加樣；所有成分加完后，離心去除氣泡。
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