常見的RT-qPCR流程一般分為RNA提取，逆轉錄、熒光定量PCR三個步驟，當有的課題需要對某物種進行多種處理后，檢測某個基因的表達水平，以驗證該基因應對不同脅迫壓力的耐受力；或者經(jīng)某種病原菌侵染后，檢測寄主不同基因的表達水平，以探究可能涉及的通路及互作機理等……對于這幾類樣本數(shù)量較大，但樣本只需要檢測一次的實驗方案，我們常常推薦一步法RT-qPCR，即逆轉錄與熒光定量PCR配制一管體系，只需一次上機即可完成表達量的檢測。

由于將RNA逆轉錄與熒光定量PCR的體系配制合為一步，那么對于實驗操作的精準度及污染控制就極為重要，針對一步法RT-qPCR的特殊性，以下總結了一步法RT-qPCR實驗優(yōu)化小技巧可有效提高實驗結果的穩(wěn)定性及準確性。

1. 目的片段選擇

①　選擇80-200 bp擴增子可保證PCR擴增效率zui大化

②　片段GC含量建議控制在40% ~ 60%

③　避免擴增子與模板其他位置出現(xiàn)長片段的重復序列

④　避免擴增子出現(xiàn)二級結構

2. RNA模板制備

①　盡量選擇高產(chǎn)量、高純度的RNA提取試劑

②　RNA可以保存在含有EDTA溶液 (1 × TE) 中，EDTA可螯合金屬離子來消除對RNase的催化作用，以此保證RNA的完整性

③　RNA提取后可以使用DNase I (ATG #E103) 消化基因組DNA殘留

3. 引物設計

①　常規(guī)引物長度15-30 nt，理想的引物GC含量40-60%，Tm值盡量接近60℃，且上下游引物Tm值相差盡量3℃以內，避免4個重復性的堿基序列，尤其是4個G堿基

②　引物濃度按說明書推薦值添加，引物投入量過多，可能產(chǎn)生引物二聚體或非特異擴增，熔解曲線會出現(xiàn)雜峰

③　以cDNA為模板時，建議引物區(qū)域跨越內含子，這樣減少以基因組DNA模板進行擴增的假陽性

4. 探針設計

①　常規(guī)探針長度15-30 nt，以保證熒光基團能夠有效猝滅，GC含量保持40-60%

②　一般情況下，非熒光猝滅基團比熒光猝滅基團更有信噪比

③　避免5’端為G堿基，否則會猝滅熒光基團

④　設計的探針應該結合到正義鏈或反義鏈上

⑤　一般探針Tm值要比引物Tm值高5-10℃，保證引物結合前探針的全部序列與模板充分結合

5. 多重擴增

①　避免探針、引物之間及目的序列之間沒有重疊序列

②　設計探針時，保證每個目的序列有唯yi的用于檢測的熒光基團

③　根據(jù)實時定量PCR儀檢測范圍來選擇熒光基團，熒光報告基團的發(fā)射光譜不能有重疊

④　在單重反應中檢測每一組引物/探針組合，以設置一個基線標準，確保在多重PCR時Ct值接近

⑤　高豐度目的序列可搭配低強度熒光染料，低豐度目的序列則搭配高強度熒光染料

6. 逆轉錄

①　一般建議逆轉錄這一步的反應溫度按照試劑說明書設置，對于具有復雜二級結構或高GC區(qū)域的模板，建議提高反應溫度，有助于提升擴增效率和靈敏度。

7. 循環(huán)條件

①　一般情況下，按照說明書中的循環(huán)條件即可達到最佳效果

②　可以進行較長片段擴增 (>400 bp)，但可能需要優(yōu)化延伸時間

③　對于大多數(shù)情況，40個循環(huán)是足夠的，極低起始量的可以進行45個循環(huán)

8. 建立反應

①　為了達到最佳結果，在熱循環(huán)之前請將反應體系放在冰上

②　對于96孔板，推薦使用20 μl反應體系。使用384孔板，推薦10 μl反應體系

③　每一個樣本應設置三個重復，保證每一個擴增子包含陰性對照 (NTC)

④　為了避免交叉污染，熱循環(huán)前加入熱敏UDG，37℃處理10 min

9. 檢測評估

①　確保至少三個10倍梯度稀釋模板的擴增效率達到90-110%，相關系數(shù)（R2) 應>0.99

②　通過產(chǎn)物的長度、測序或熔解曲線分析確認其特異性

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