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瘦素檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）操作說明
瘦素檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：瘦素檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）
英文名稱：Leptin (Sandwich) ELISA
【產(chǎn)品規(guī)格】
96T
【預(yù)期用途】
試劑盒可用于人血清和血漿中瘦素的定量檢測。
【檢測原理】
DRG公司的瘦素酶免實驗是一種基于夾心法原理的固相酶免吸附實驗（ELISA），微孔內(nèi)包被有能結(jié)合瘦素分子上*抗原位點的單克隆抗體。含有內(nèi)源性瘦素的病人樣本在包被孔中與特異性兔抗瘦素抗體進行溫育，之后就會形成一個夾心復(fù)合物。溫育后，用洗滌液洗去未結(jié)合的物質(zhì)，再加入鏈霉親和素過氧化物酶復(fù)合物來檢測結(jié)合的瘦素，加入底物溶液，顏色強度與病人樣品中瘦素的濃度成正比。
【試劑盒組成成分】
微孔板 12×8
包被了抗瘦素單克隆抗體。
標準品（0~5） 6×0.5ml
濃度0、2、5、25、50、100ng/ml 內(nèi)含無汞防腐劑。
質(zhì)控品 2×0.5ml
即用型、具體數(shù)值與范圍請見試劑瓶標簽或QC質(zhì)控單、內(nèi)含無汞防腐劑。
分析緩沖液 1×11ml
即用型
抗血清 1×11ml
即用型、生物素化抗瘦素單抗、內(nèi)含無汞防腐劑。
酶聯(lián)物 1×11ml
即用型、含辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素、內(nèi)含無汞防腐劑。
底物液 1×14ml
含TMB、即用型。
終止液 1×14ml
即用型、內(nèi)含0.5M的H2SO4、避免接觸終止液、以免刺激皮膚或灼傷皮膚。
洗滌液 1×30ml
40倍濃縮
注：根據(jù)需要可額外訂購樣本稀釋用的零標準品。
所需材料（未提供）
1) 酶標儀 （450±10nm）
2) 精確取樣槍
3) 吸水紙
4) 蒸餾水
5) 計時器
6) 半對數(shù)坐標紙或數(shù)據(jù)處理軟件
【儲存條件】
未開封的試劑在2~8℃下可保存至有效期，不要使用過期的試劑。
開封的試劑和微孔板必須貯存于2~8℃，密封袋一旦打開后，應(yīng)立即密封好。
【樣本要求】
此試驗采用血清或血漿。
不要使用溶血，脂血或黃疸血樣本。
注意：含有疊氮化物的樣本不能使用。
樣本采集
血清
靜脈采血采集全血，允許凝集，室溫下離心分離出血清；樣本未*凝集前不能離心；含有抗凝劑的樣本可能需要更長的凝集時間。
血漿
將全血采集至含有抗凝劑的離心管內(nèi)，離心分離。
樣本儲存
樣本采集后蓋好蓋子，2~8℃下可保存24小時；若要保存更長時間，則需凍存于-20℃；解凍的樣本實驗前來回倒置數(shù)次混勻。
樣本稀釋
初次試驗中，若出現(xiàn)樣本的濃度值高于最高標準，則需將樣本進行進一步的稀釋，并重新檢測，最終結(jié)果應(yīng)乘以相關(guān)的稀釋因子。
例如：
A) 1:10稀釋 10ul的血清+90ul的零標準品（充分混合）
B）1:100稀釋 10ulA)1:10稀釋的+90ul的零標準品（充分混合）
【檢測方法】
實驗前將所有試劑和試驗所需板條平衡至室溫。
標準品
加0.5ml的去離子水至標準品試劑瓶內(nèi)，，靜置10分鐘，使用前混勻。
注意：配制的標準品在2~8℃下可保存6周，需保存更長時間需在-20℃下凍存。
質(zhì)控品
加0.5ml的去離子水至質(zhì)控品試劑瓶內(nèi)，，靜置10分鐘，使用前混勻。
注意：配制的標準品在2~8℃下可保存6周，需保存更長時間需在-20℃下凍存。
洗滌液
30ml的濃縮洗滌液+1170ml的去離子水混合，得到1200ml的即用型洗滌液；稀釋的洗滌液可在室溫下保存2周。
檢測步驟
每次實驗都要建立標準曲線。
1) 將實驗所需板條固定于板架上。
2) 加15ul的標準品，質(zhì)控品和樣本于相應(yīng)的孔內(nèi)。
3) 每孔加100ul的分析緩沖液；充分混合10秒，此步中*混合很重要。
4) 室溫下，不蓋板，溫育120min。
5) 棄去孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔加300ul的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干。
注意：試驗靈敏度和精確度與洗板準確與否相關(guān)。
6) 每孔加100ul的抗血清。
7) 室溫下溫育30min。
8) 棄去孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔加300ul的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干。
9) 每孔加100ul的酶聯(lián)混合物。
10) 室溫下溫育30min。
11) 棄去孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔加300ul的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干。
12) 每孔加100ul的底物液。
13) 室溫下溫育15min。
14) 每孔加50ul的終止液。
15) 加入終止液10min內(nèi)在酶標儀450±10nm處讀數(shù)。
【結(jié)果計算】
1) 計算各標準品，質(zhì)控品和樣本的OD均值。
2) 在半對數(shù)坐標紙上，以標準品的OD均值為Y軸，濃度為X軸繪制標準曲線。
3) 樣本的濃度可直接從標準曲線上讀取。
4) 自動計算方法：說明書中的標準曲線是通過4參數(shù)邏輯函數(shù)法計算得到，4PL是最佳方法，其他的方法可能會有些許的偏差。
5) 樣本濃度可直接從標準曲線上讀?。蝗魳颖緷舛戎蹈哂谧罡邩藴势罚瑒t需進一步稀釋重新檢測；最終結(jié)果計算時應(yīng)乘以相關(guān)的稀釋因子。
典型標準曲線示例
以下數(shù)據(jù)僅供解釋說明，不能用作試驗的計算。
標準品（ng/ml） | OD值（450nm） |
0 | 0.02 |
2 | 0.07 |
5 | 0.16 |
25 | 0.74 |
50 | 1.41 |
100 | 2.30 |
【注意事項】
1) 此試劑盒僅供科研使用。
2) 試劑盒內(nèi)所有含人血清或血漿的試劑都已經(jīng)過FDA檢測HIV I/II, HBsAg 和HCV呈陰性，但使用及處理時應(yīng)視其為潛在生化危害物質(zhì)對待。
3) 實驗開始前，認真閱讀試劑盒內(nèi)配套的使用說明書，確保*理解。
4) 微孔板可拆，未使用的板條應(yīng)放回至密封袋內(nèi)貯存于2-8℃。
5) 每次加樣要快，加樣順序應(yīng)一致。
6) 一個試劑瓶只能用于裝一種試劑，尤其是底物液試劑瓶；若用裝過了酶聯(lián)物的試劑瓶重新裝底物液的話則會發(fā)生的溶液顏色改變，且不能將剩余溶液倒回至原試劑瓶，以免污染試劑。
7) 微孔板內(nèi)的試劑應(yīng)*混勻，確保得到好的結(jié)果，不要重復(fù)使用微孔板。
8) 試驗中，不要使微孔出現(xiàn)干燥，洗板后立即加入下一個試劑。
9) 實驗前將所有試劑平衡至室溫，溫度會影響吸收值的讀取，但是樣本值不會受影響。
10) 不要用嘴吸樣，避免接觸試劑和樣本。
11) 實驗區(qū)禁止抽煙，飲食或化妝。
12) 處理樣本和試劑時佩戴一次性手套，微生物污染的試劑或樣本會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。
13) 嚴格按照相關(guān)國家生物安全法規(guī)要求來處理。
14) 不要使用過期的試劑。
15) 加樣量嚴格按說明書要求來，使用校準加樣器和酶標儀則會得到最佳結(jié)果。
16) 不要混合使用不同批次的試劑，也不能交換同一批次的板條；運輸或貯存環(huán)境不同和微孔板的結(jié)合特性會導(dǎo)致結(jié)果些許差異。
17) 避免接觸終止液，會腐蝕和燒傷皮膚。
18) 含有Proclin 300, BND 和 MIT作為防腐劑的試劑應(yīng)避免接觸，若接觸到則立即用大量水進行沖洗。
19) TMB底物液具有刺激作用，若接觸到則立即用肥皂清洗和大量水沖洗。
20) 化學(xué)物質(zhì)和配制的試劑應(yīng)根據(jù)國家生化危害安全規(guī)章要求處理。
21) 試劑盒內(nèi)相關(guān)危害物質(zhì)信息詳見MSDS，可向DRG索取。
【操作注意事項】
1) 實驗前，所有試劑和樣本都應(yīng)平衡至室溫，混合時避免出現(xiàn)氣泡。
2) 實驗一旦開始，必須無中斷的完成全部試驗。
3) 避免交叉污染，每次加樣時都使用新的槍頭。
4) 吸收值與溫育時間和溫度有關(guān)，試驗開始前，將所有試劑準備好，打開蓋子，所需板條固定于板架上等，確保無間斷的，時間間隔一致的加樣。
5) 酶反應(yīng)一般規(guī)則，時間和溫度是一個線性相關(guān)關(guān)系。
僅供科研使用
