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人胰島素(INS)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒使用說明書
l該試劑盒用于體外定量檢測人 血清、血漿或其他相關(guān)生物液體中INS的濃度。
實(shí)驗(yàn)原理：
本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被有人胰島素（INS）捕獲抗體的微孔中，依次加入樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記的檢測抗體，HRP酶結(jié)合物，中間經(jīng)過溫育和洗滌，用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人胰島素（INS）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。
試劑盒組成：
名稱 | 96孔配置 | 48孔配置 | 備注 |
預(yù)包被96孔酶標(biāo)板 Pre-coated Assay Plate | 8孔×12條 | 8孔×6條 | 無 |
標(biāo)準(zhǔn)品 Standard | 2支 | 1支 | 按說明書進(jìn)行稀釋 |
通用稀釋液 Universal Diluent | 2x20mL | 1x20mL | 無 |
濃縮生物素化檢抗100× Biotin-antibody (100×) | 120μL | 60μL | 按說明書進(jìn)行稀釋 |
濃縮酶結(jié)合物100× Streptavidin-HRP (100×) | 120μL | 60μL | 按說明書進(jìn)行稀釋 |
20×洗滌液 Wash Buffer (20×) | 2x10mL | 1x10mL | 按說明書進(jìn)行稀釋 |
底物（TMB） TMB Substrate | 10mL | 5mL | 無 |
終止液 Stop Solution | 6mL | 3mL | 無 |
封板膜 Plate Sealer | 4張 | 4張 | 無 |
說明書 Instruction Manual | 1份 | 1份 | 無 |
試劑盒參數(shù)：
性能 | |
靈敏度 | 0.076ng/mL |
檢測范圍 | 0.156-10ng/mL |
重復(fù)性 | 板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。 |
特異性 | 可檢測樣本中人的INS，且與其類似物無明顯交叉反應(yīng) |
需自備的設(shè)備及試劑：
1. 450±10nm 濾光片酶標(biāo)儀
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL.
3. Eppendorf 移液器.
4. 蒸餾水或去離子水.
5. 脫脂棉吸水紙.
6. 37℃恒溫箱.
8. 準(zhǔn)備若干個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋管.
樣本處理及要求：
1. 血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
5. 其它生物標(biāo)本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。
6. 樣品外觀：樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。
7. 樣品保存：樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個(gè)月內(nèi)檢測），或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融，標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。
檢測前準(zhǔn)備工作：
1. 提前從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度工作液配制：加入1mL通用稀釋液至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為10ng/mL)，然后按照以下濃度：10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、 0.312ng/mL、0.156ng/mL、0ng/mL進(jìn)行稀釋。倍比稀釋方法：取7支 EP管，每管中加入500μL通用稀釋液,10ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混勻配成5ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，按此步驟往后依次吸取混勻。最后一管直接作為空白孔，不需要再從倒數(shù)第二管中吸取液體，具體如下圖。
3. 生物素化檢抗工作液配制：使用前15分鐘將濃縮生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，以通用稀釋液將100×濃縮生物素化抗體稀釋成1×工作濃度(例：10μL濃縮液+990μL通用稀釋液)，當(dāng)日使用。
4. 酶結(jié)合物工作液配制：使用前15分鐘將100x濃縮酶結(jié)合物于1000×g離心1分鐘，以通用稀釋液將100×濃縮HRP酶結(jié)合物稀釋成1×工作濃度(例：10μL濃縮液+990μL通用稀釋液)，當(dāng)日使用。
5. 1×洗滌液配制：取10ml 20×洗滌液到190ml蒸餾水中（從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正常現(xiàn)象，可放置室溫，輕搖均勻，待結(jié)晶溶解后再配置)。
操作步驟：
1. 從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2. 加樣：分別將樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照100μl每孔加入相應(yīng)孔中，空白孔加入100μL通用稀釋液。蓋上封板膜后37℃溫育1小時(shí)。（建議：將待測樣本用通用稀釋液低稀釋1倍后再加入酶標(biāo)板內(nèi)測試。從而減少基質(zhì)效應(yīng)對測試結(jié)果的誤差影響，最后計(jì)算樣本濃度時(shí)需乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù)。所有的待測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品在檢測中建議設(shè)立復(fù)孔）。
3. 加生物素化抗體：取出酶標(biāo)板，棄去液體，不用洗滌。每孔直接加入生物素化抗體工作液100μL，蓋上封板膜后37℃溫育1小時(shí)。
4. 洗板：棄去液體，每孔加入300μL 1x洗滌液，靜置1分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板3次（也可用洗板機(jī)洗板）。
5. 加酶結(jié)合物工作液：每孔加入酶結(jié)合物工作液100μL，蓋上封板膜后37℃溫育30分鐘。
6. 洗板：棄去液體按步驟4洗滌方法，洗板5次。
7. 加底物：每孔加入底物(TMB)90μL，蓋上封板膜，37℃避光溫育15分鐘。
8. 加終止液：取出酶標(biāo)板，每孔直接加入終止液50μL，立即在450nm波長處測定各孔的OD值。
結(jié)果判斷：
1. 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在雙對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時(shí)去掉空白組的值)。
2. 若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
典型數(shù)據(jù)和參考曲線：
以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
濃度（ng/mL) | 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.625 | 0.312 | 0.156 | 0 |
OD值 | 2.22 | 1.56 | 0.92 | 0.63 | 0.42 | 0.25 | 0.18 | 0.08 |
校正OD值 | 2.14 | 1.48 | 0.94 | 0.55 | 0.34 | 0.17 | 0.1 | - |
試劑盒性能：
1. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。
2. 回收率：在選取的健康人血清、血漿和組織勻漿中加入3個(gè)不同濃度水平的人INS，計(jì)算回收率
樣本類型 | 范圍 | 平均回收率 |
血清（n=8) | 84-101 | 96 |
血漿(n=8) | 92-105 | 102 |
細(xì)胞培養(yǎng)上清(n=8) | 96-108 | 105 |
3. 線性稀釋：分別在選取的4份健康人血清、血漿和組織勻漿中加入高濃度人INS，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋，評估線性。評估線性。
稀釋比例 | 回收率（%） | 血清 | 血漿 | 細(xì)胞培養(yǎng)上清 |
1：2 | 范圍（%） | 84-95 | 88-96 | 90-110 |
平均回收率（%） | 91 | 93 | 96 | |
1：4 | 范圍（%） | 89-103 | 87-108 | 105-115 |
平均回收率（%） | 94 | 98 | 108 |
注意事項(xiàng)：
1. 嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
2. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。
4. 底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。
5. 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。
6. 在儲存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
8. 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。
9. 不能使用過期產(chǎn)品。
10. 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
