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豬藍耳病毒抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）
使用說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名：豬藍耳病毒抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）
英文名：Test Kit for Antibodies to Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus （ELISA）
【包裝規(guī)格】 96T×1/盒、96T×2/盒、96T×5/盒
【預期用途】 豬藍耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）（又稱豬藍耳病毒）引起的以成年豬生殖障礙、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎，以仔豬呼吸異常為特征的傳染病。本病是一種免疫抑制病，常繼發(fā)其他病原感染，病死率J高。
本試劑用于檢測豬血清中豬藍耳病毒抗體，可用于豬藍耳病毒疫苗免疫效果評價。
【原 理】
本試劑盒由預包被豬藍耳病毒重組蛋白的酶標板、酶標記物及其他配套試劑組成，應用酶聯(lián)免疫法（ELISA）原理檢測豬血清、血漿樣本中豬藍耳病毒抗體。實驗時在酶標板中加入對照血清和待檢樣本，經(jīng)溫育后若樣品中含有豬藍耳病毒抗體，則將與酶標板上抗原結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的其他成分后；再加入酶標記物，與酶標板上抗原抗體復合物發(fā)生特異性結(jié)合；再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶標記物，在孔中加TMB底物液，與酶標結(jié)合物反應形成藍色產(chǎn)物，顯色深淺與樣品中的特異性抗體含量成正相關；加入終止液終止反應后，產(chǎn)物變?yōu)辄S色；用酶標儀在450nm波長測定各反應孔中的吸光值，即可知樣品是否含有豬藍耳病毒抗體。
【試劑盒組成】
序號 | 名稱 | 規(guī)格/96T×1 | 規(guī)格/96T×2 | 規(guī)格/96T×5 |
1 | 酶標記物 | 11ml×1(紅蓋) | 11ml×2(紅蓋) | 26ml×2(紅蓋) |
2 | 樣品稀釋液 | 50ml×1(黃蓋) | 50ml×1(黃蓋) | 200ml×1(黃蓋) |
3 | 20X濃縮洗滌液 | 40ml×1(白蓋) | 40ml×1(白蓋) | 200ml×1(白蓋) |
4 | 底物液A | 6ml×1(白蓋) | 11ml×1(白蓋) | 26ml×1(白蓋) |
5 | 底物液B | 6ml×1(黑蓋) | 11ml×1(棕蓋) | 26ml×1(黑蓋) |
6 | 終止液 | 6ml×1(黃蓋) | 11ml×1(黃蓋) | 26ml×1(黃蓋) |
7 | 陽性對照 | 1.0 ml×1(紅蓋) | 1.5 ml×1(紅蓋) | 2.0 ml×1(紅蓋) |
8 | 陰性對照 | 1.0 ml×1(綠蓋) | 1.5 ml×1(綠蓋) | 2.0 ml×1(綠蓋) |
9 | 酶標板 | 96T×1 | 96T×2 | 96T×5 |
10 | 蓋板膜 | 1 | 2 | 5 |
11 | 自封袋 | 1 | 1 | 2 |
12 | 說明書 | 1 | 1 | 1 |
13 | 稀釋板 | 1 | 2 | 5 |
【儲存及有效期】 2～8℃保存，有效期12個月。
包被板開封后請于2～8℃避光保存，避免受潮。使用期限為2個月。
【適用儀器】 含450nm、630nm波長的酶標儀，37℃恒溫設備，可調(diào)微量移液器。
【樣品準備】
1.取動物全血按常規(guī)方法制備血清，要求血清清亮，無溶血、無污染。樣品1周內(nèi)可于2～8℃保存，長期需置-20℃保存。
2.用樣品稀釋液將待檢血清按40倍稀釋（如5μl血清加入195μl樣品稀釋液中，混勻）。陰、陽性對照不用稀釋。
3.濃縮洗滌液使用前應恢復至室溫使沉淀溶解，然后用蒸餾水或去離子水作20倍稀釋成工作洗滌液(如19份蒸餾水或去離子水+1份濃縮洗滌液)。
【檢驗方法】
1.使用前將試劑盒置室溫30分鐘，恢復至室溫。
2.取所需用量酶標板條，設陰性/陽性對照各2孔，未用的板條盡快密封，2～8℃保存。
3.陰、陽性對照孔分別加入陰、陽性對照100μl；樣品孔每孔加入稀釋后的樣品100μl。
4.混勻，蓋好蓋板膜，置37℃（推薦水?。┍芄夥磻?/span>30分鐘。
5.甩去孔內(nèi)液體，每孔加350μl工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復洗滌5次，最后一次拍干。
6.每孔加酶標記物100μl，蓋好蓋板膜，置37℃避光反應30分鐘。
7.洗滌，同步驟5。
8.每孔依次加底物液A、底物液B各50μl，混勻，蓋好蓋板膜，置37℃避光反應10分鐘。
9.每孔加終止液50μl，混勻，于450nm(可用630nm作參比波長）測定各孔吸光值。
【參考值】 實驗正常的情況下，陰性對照的平均OD值即ODNC應≤0.3，陽性對照的平均OD值即ODPC應≥0.6。
【檢驗結(jié)果的判定】
1.樣品的OD值即ODS；
2.閾值計算：SP值=（ODS-ODNC）/（ODPC-ODNC）；
SP值≥0.2，結(jié)果判定為陽性；SP值＜0.2，結(jié)果判定為陰性。
3.本實驗結(jié)果為陰性時表明豬只抗體水平不足，建議補打相應疫苗。
【試驗方法的局限性】
該試驗僅作為定性檢測豬血清、血漿中藍耳病毒抗體，根據(jù)SP值高低可作抗體水平強、中、弱的粗略評估。
【注意事項】
1.實驗操作時需戴手套、穿工作衣，嚴格健全和執(zhí)行消毒隔離制度，各種實驗廢棄物都應按傳染物處理。
2.終止液具有腐蝕性，應避免接觸皮膚和衣物，如不慎接觸請立即用大量自來水沖洗。
3.酶標板從冷藏環(huán)境中取出時應恢復至室溫方可開袋，未用完的酶標板需放入有干燥劑的密封袋中保存。
4.濃縮洗滌液在低溫時容易結(jié)晶，使用時需恢復至室溫以溶解。
5.洗滌時各孔均需加滿液體，防止孔口有游離酶不能洗凈。
6.用于檢測的樣品應保持新鮮。
7.試驗結(jié)果的判定必須以酶標儀讀數(shù)為準。
8.不同批號試劑組分不得混用。
