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關(guān)于干細(xì)胞融合的實(shí)驗(yàn)步驟
閱讀：258 發(fā)布時(shí)間：2017-9-19| 提 供 商 | 上海谷研實(shí)業(yè)有限公司 | 資料大小 | 8.9KB |
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干細(xì)胞融合是人工定向新細(xì)胞品系的重要手段，也是單克隆細(xì)胞系的關(guān)鍵技術(shù)。在保證有良好的親本細(xì)胞、穩(wěn)定和良好的培養(yǎng)體系的條件下，細(xì)胞融合的成敗和融合率則取決于融合劑和操作技巧。細(xì)胞融合的助融劑和助融手段主要有三種；
生物學(xué)方法：用仙臺(tái)病毒或雞新城疫病毒作助融劑。
物理學(xué)方法：用電融合儀發(fā)出的脈沖電流使相鄰的兩細(xì)胞穿孔而融合。
化學(xué)方法：用聚乙二醇或血卵磷脂作助融劑。
PEG作助融劑是比較方便簡單的操作方法，具體方法如下：
一、實(shí)驗(yàn)材料
1.1 眼科鑷子、剪刀數(shù)把、固定板。
1.2 37℃溫水。
1.3 酒精燈、離心管架、離心管、5-10ml吸管、1ml吸管、滴管、計(jì)數(shù)池、平皿數(shù)個(gè)。
二、實(shí)驗(yàn)試劑
2.1 融合劑：50%PEG W=3000
PEG3000 1g
RPMI1640 1ml
8-10磅滅菌
2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)液（RPMI1640）
RPMI1640 一包 (10.4g)
L-G （L-谷氨酰胺） 0.3g
HEPES 3.0g
碳酸氫鈉 3.0g
慶大霉素 一支
三蒸水加至 1000ml
2.3 1640*培養(yǎng)液
基礎(chǔ)培養(yǎng)液 180ml
胎牛血清 20ml
2.4 HT培養(yǎng)液（終濃度H為1×10-4M，T為1.6×10-5M）
基礎(chǔ)培養(yǎng)液 197.5ml
HT濃縮液（100×） 2.5ml
胎牛血清 50ml
一次融合約配250毫升
2.5 HAT培養(yǎng)液（終濃度A為4×10-7M）
基礎(chǔ)培養(yǎng)液 197.5ml
HAT濃縮液（100×） 2.5ml
胎牛血清 50ml
2.6 細(xì)胞凍存液
1640*培養(yǎng)液 70ml
DMSO 10ml
胎牛血清 20ml
2.7 3%醋酸溶液
30%乙酸 10ml
dH2O 90ml
三、實(shí)驗(yàn)步驟
3.1 脾細(xì)胞制備：取加強(qiáng)免疫小鼠一 只，眼眶采血后脫臼處死，在75%酒精中消毒后取脾臟，去除結(jié)締組織，制備脾細(xì) 胞懸液，轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加RPMI1640至30ml，1500~2000rpm離心5分鐘，棄上清，加RPMI1640至30ml，白細(xì)胞稀 釋液稀釋20倍，計(jì)數(shù)，取1×108個(gè)細(xì)胞待用。
3.2 骨髓瘤細(xì)胞制備：取3瓶生長狀態(tài)良好的（活細(xì)胞數(shù)>95%）骨髓瘤細(xì)胞，將之*吹下，轉(zhuǎn)移到50ml 離心管中，加RPMI1640至30ml，1500~2000rpm離心5分鐘，棄上清，加RPMI1640至30ml，RPMI1640稀釋10倍，計(jì) 數(shù)，取2×107個(gè)細(xì)胞待用。
3.3 細(xì)胞混合：脾細(xì)胞:骨髓瘤=5：1，混合，1500~2000rpm離心5分鐘。
注 意：由于細(xì)胞融合是個(gè)隨機(jī)過程，母細(xì)胞比例不一，會(huì)影響融合產(chǎn)物；或是兩種母細(xì)胞融合而成的雜交細(xì)胞，或是一種細(xì)胞自身融合產(chǎn)物。多數(shù)實(shí)驗(yàn)者采用骨髓瘤 細(xì)胞：脾細(xì)胞＝1：5，也有人采取其他比例，如骨髓瘤細(xì)胞：脾細(xì)胞＝1：5，甚至是1：1。減少脾細(xì)胞用量目的是降低脾細(xì)胞自身融合的機(jī)率。
3.4 細(xì)胞融合：將離心上清倒干，把沉淀細(xì)胞塊彈成糊狀，置37℃水浴，
在1分鐘內(nèi)加入1ml融合劑，并攪拌細(xì)胞，37℃水浴放置 45秒，
在1分鐘內(nèi)加入1ml 1640并攪拌細(xì)胞終止融合劑的融合作用，500rpm離心7分鐘，棄上清。
2分鐘內(nèi)加入5ml 1640并攪拌細(xì)胞
2分鐘內(nèi)加入10ml 1640并攪拌細(xì)胞
2分鐘內(nèi)加入10ml 1640并攪拌細(xì)胞
3.5 細(xì)胞培養(yǎng)：輕輕將細(xì)胞彈勻，緩緩加入HAT培養(yǎng)液至所需體積，將細(xì)胞重懸，輕輕地將之混勻，加到預(yù)先準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)細(xì)胞板中。 10ml吸管滴加1滴（配8ml/板），排槍滴加80~100微升（配10ml/板），37℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)、觀察。
3.6 細(xì)胞培養(yǎng)、換液：細(xì)胞融合后天開始，對干細(xì)胞進(jìn)行仔細(xì)觀察，記錄好細(xì)胞的生長狀態(tài)、每孔雜交細(xì)胞瘤個(gè)數(shù)、塊數(shù)、培養(yǎng)液有無污染、飼養(yǎng)細(xì)胞的狀況。培養(yǎng)3~5天HAT培養(yǎng)液換液一次，10天換HT培養(yǎng)液培養(yǎng)至20天，換1640*培養(yǎng)液。
Multi-class antibodies Anti-PAK1 p21激活激酶1抗體 規(guī)格： 0.2ml
Multi-class antibodies Anti-PAK2 p21激活激酶2抗體 規(guī)格： 0.1ml
Multi-class antibodies Anti-PAI-1 纖溶酶原激活物抑制因子抗體 規(guī)格： 0.1ml
Multi-class antibodies Anti-PAK4 p21激活激酶4抗體 規(guī)格： 0.2ml
Multi-class antibodies Phospho-PAK4 (Ser474)/PAK5 (Ser602)/PAK6 (Ser560) 磷酸化p21激活激酶4、5、6抗體 規(guī)格： 0.1ml
Multi-class antibodies Anti-Phospho-PAK4 (Ser99) 磷酸化p21激活激酶4抗體 規(guī)格： 0.1ml
Multi-class antibodies Anti-PAI-2 纖溶酶原激活物抑制因子2抗體 規(guī)格： 0.2ml
Multi-class antibodies Anti-phosphor-PAK1+PAK2+PAK3 (Ser141) 磷酸化p21激活激酶1/2/3抗體 規(guī)格： 0.1ml
干細(xì)胞