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酚氧化酶（PO）檢測(cè)|茁彩生物
閱讀：102 發(fā)布時(shí)間：2025-3-4酚氧化酶（phenoloxidase，PO）是一種含銅的氧化酶，在生物的免疫防御、傷口愈合、色素形成等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
酚氧化酶能夠催化酚類物質(zhì)（如鄰苯二酚、L - 多巴等）氧化成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)進(jìn)一步聚合形成有色的色素，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系中生成的有色物質(zhì)在特定波長(zhǎng)下的吸光度變化，來(lái)反映酚氧化酶的活性。不同的酚類底物在被酚氧化酶催化氧化后生成的產(chǎn)物顏色不同，且在不同波長(zhǎng)下有最大吸收峰，例如鄰苯二酚氧化產(chǎn)物在 490nm 左右有吸收峰，L - 多巴氧化產(chǎn)物在 475nm 左右有吸收峰。
檢測(cè)步驟
樣本制備：
生物組織（如昆蟲(chóng)的血淋巴、動(dòng)物的組織器官等）中的酚氧化酶，需要先對(duì)樣本進(jìn)行處理。以昆蟲(chóng)血淋巴為例，用合適的抗凝劑（如含有PMSF的緩沖液）收集血淋巴，防止酚氧化酶在體外被激活而發(fā)生自氧化。若檢測(cè)的是組織中的酚氧化酶，則需要將組織勻漿，然后離心取上清液作為酶液，勻漿過(guò)程中可使用含有蛋白酶抑制劑的緩沖液，以保護(hù)酶的活性。
標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：配制一系列不同濃度的酚類底物的氧化產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)溶液（如醌類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液），在其最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
酶活性測(cè)定：在反應(yīng)體系中加入一定量的酶液（上述制備的樣本上清液）、酚類底物溶液（如一定濃度的鄰苯二酚或 L - 多巴溶液）和緩沖液（如 pH 6.0-7.5 的磷酸緩沖液，維持反應(yīng)體系的 pH 穩(wěn)定），總體積根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求確定（如 1mL）。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組中可加入經(jīng)熱處理使酶失活的酶液，其他成分與實(shí)驗(yàn)組相同。將反應(yīng)體系置于適宜溫度（如 25℃或 37℃）的恒溫振蕩器中反應(yīng)一定時(shí)間（如 10-30 分鐘），然后加入適量的終止液（如強(qiáng)酸或強(qiáng)堿溶液使酶失活）終止反應(yīng)。
吸光度測(cè)定與結(jié)果計(jì)算：將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至比色皿中，在酚類底物氧化產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)下，使用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出反應(yīng)體系中生成的氧化產(chǎn)物的量，再根據(jù)酶液的加入量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)體系體積等參數(shù)，計(jì)算出酚氧化酶的活性，通常以單位時(shí)間內(nèi)生成一定量氧化產(chǎn)物所需的酶量來(lái)表示（如 U/mL）。