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用于寬場(chǎng)顯微鏡的高速熒光壽命成像

快速的細(xì)胞過程、移動(dòng)的粒子和快速的圖像采集歷來是使用單光子計(jì)數(shù)技術(shù)進(jìn)行壽命成像的挑戰(zhàn)。寬場(chǎng) FLIM 套件通過在寬場(chǎng)照明裝置中實(shí)現(xiàn)視頻速率壽命成像，解決了這些限制。該套裝將Pi Imaging的高分辨率SPAD5122 相機(jī)與PicoQuant的多功能脈沖激光器組合以及通過NovaLITE軟件進(jìn)行的GPU 加速FLIM分析結(jié)合在一起。它專為兼容光片和其他寬場(chǎng)顯微鏡系統(tǒng)而設(shè)計(jì)，通過脈沖激發(fā)和時(shí)域門控檢測(cè)引入了FLIM功能。NovaLITE簡(jiǎn)化了數(shù)據(jù)分析，針對(duì) TIFF 文件格式進(jìn)行了優(yōu)化，確保了高效、準(zhǔn)確的處理。

特點(diǎn)：

• 使用512x512像素時(shí)間門控SPAD相機(jī)進(jìn)行寬場(chǎng)壽命成像

• 比共焦FLIM快達(dá)100倍

• 結(jié)合落射熒光和光片顯微鏡進(jìn)行測(cè)試

• 激光選項(xiàng)適用于各種應(yīng)用

• 易于使用的基于GPU的分析軟件NovaLITE

應(yīng)用：

FLIM寬場(chǎng)顯微鏡的應(yīng)用

下面，我們將重點(diǎn)介紹我們的寬視場(chǎng)FLIM套裝所擅長(zhǎng)的兩個(gè)關(guān)鍵應(yīng)用： 光片F(xiàn)LIM和寬場(chǎng)FLIM。從二維寬場(chǎng)顯微鏡到使用光片技術(shù)對(duì)活體樣本進(jìn)行三維成像，每一種應(yīng)用都展示了寬場(chǎng)FLIM套件在為高級(jí)生物研究提供高速、高精度成像方面的多功能性。

光片F(xiàn)LIM

在光片顯微鏡（或選擇性平面照明顯微鏡，SPIM）中，樣品的一個(gè)平面被光片照射，光片通常由圓柱透鏡或來回掃描的光束產(chǎn)生。被照亮的平面隨后通過相機(jī)成像。光片顯微鏡因其快速、柔和和三維功能，非常適合對(duì)大型活體樣本進(jìn)行研究。壽命成像提供的傳感或同步多路復(fù)用與這些優(yōu)勢(shì)相輔相成，使光片 FLIM 成為一種非常有效的組合。

我們與法國(guó)艾克斯-馬賽大學(xué)（Aix-Marseille Université）的研究人員合作，擴(kuò)展了一種光片顯微鏡，以實(shí)現(xiàn)光片F(xiàn)LIM。該顯微鏡是一種專門的單物鏡光片，針對(duì)有機(jī)體的高通量成像進(jìn)行了優(yōu)化。我們將該顯微鏡與用于脈沖照明的光纖耦合VisUV488和SPAD5122傳感器（高速版本）相結(jié)合，在類器官樣品上進(jìn)行FLIM。

圖中顯示了光片 FLIM 如何用于同步多路復(fù)用。我們對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞生成的活體器官進(jìn)行了成像。細(xì)胞核表達(dá) H2B-GFP，細(xì)胞膜用 Flipper-TR 染色。

下面的視頻顯示的是有機(jī)體的三維成像，通過生命周期進(jìn)行多路復(fù)用。對(duì)于該數(shù)據(jù)集，光片由來回掃描的高斯光束產(chǎn)生（488nm波長(zhǎng)下的平均功率約為70µW），每個(gè)Z平面的采集時(shí)間為1.1s?？潭染€為50µm。

有關(guān)其他結(jié)果，包括不同光片模式與共焦 FLIM 的比較以及活體有機(jī)體的三維張力圖譜，請(qǐng)查閱 bioRxiv 上的預(yù)印本。

寬場(chǎng) FLIM

在落射熒光寬場(chǎng)顯微鏡中，樣品的一個(gè)區(qū)域被準(zhǔn)直激光束照射。然后將激發(fā)的熒光成像到相機(jī)上。為了進(jìn)行寬場(chǎng)熒光成像，我們擴(kuò)展了一臺(tái)落射熒光顯微鏡（Olympus IX73），配備了用于照明的光纖耦合高功率530nm激光器（LDH P-FA-530XL）和高速版 SPAD5122傳感器。

圖片顯示的是商用固定細(xì)胞樣本（Gattaquant，比例尺為5µm）的寬視場(chǎng) FLIM 和共聚焦FLIM。線粒體和微管蛋白用光譜重疊的染料標(biāo)記，但可通過壽命區(qū)分開來。即使在寬場(chǎng) FLIM 上進(jìn)行 40ms的采集，也能看到這種壽命對(duì)比。圖中顯示了隨著成像速度的增加，壽命直方圖的范圍也在擴(kuò)大。采集時(shí)間為300ms的寬場(chǎng)圖像和采集時(shí)間為 5s的共聚焦圖像的壽命直方圖都是雙峰的。不過，共焦圖像中的生命周期分隔更大。這并不是門控采集的偽影，而是落射熒光顯微鏡缺乏切片的結(jié)果，在這種情況下，焦內(nèi)和焦外的壽命是混合的。寬視場(chǎng) FLIM 圖像是在激光輸出平均功率約為10mW 的情況下記錄的，相當(dāng)于視場(chǎng)中約50W/cm2。

寬場(chǎng)FLIM的高速性尤其有利于在對(duì)移動(dòng)樣品成像時(shí)避免運(yùn)動(dòng)模糊。視頻顯示了大型熒光珠在水中自由漂浮的實(shí)時(shí)畫面（比例尺10µm）。溶液中含有兩種不同類型的珠子，它們具有相似的光譜特性，但壽命不同。在視頻中，以每秒23幀的幀頻，可以根據(jù)熒光珠的壽命清楚地分辨出兩種類型的熒光珠。

相關(guān)套件：

寬視場(chǎng)FLIM組件

照明選項(xiàng)

根據(jù)照明模式（如 Epi、TIRF、光片......）和樣品的不同，寬場(chǎng) FLIM 應(yīng)用對(duì)照明光源的要求也大相徑庭。在目前測(cè)試的應(yīng)用中，所需的平均激光功率從數(shù)字掃描光片系統(tǒng)中的約 100 µW 到落射熒光寬場(chǎng)顯微鏡中的 25 mW 不等。我們將幫助您從 PicoQuant 大量的脈沖激光源組合中選擇適合您應(yīng)用的選項(xiàng)。

標(biāo)準(zhǔn)光源：

• LDH系列：皮秒半導(dǎo)體激光頭

• Prima3色增益開關(guān)皮秒激光器

高功率光源：

• VisUV：紫外、綠光、黃光和橙光皮秒激光器

• LDH-FA 系列：放大型皮秒脈沖半導(dǎo)體激光頭

探測(cè)器

探測(cè)器是Pi Imaging公司的SPAD5122 SPAD圖像傳感器，像素為512x512。該傳感器可通過納秒級(jí)的全局曝光進(jìn)行時(shí)間分辨檢測(cè)，并能以皮秒級(jí)的精度相對(duì)于激光脈沖進(jìn)行移動(dòng)。該傳感器采用微透鏡，提高了填充因子，整體計(jì)數(shù)率高達(dá)15Gcps。

*通常情況下，套件默認(rèn)包括標(biāo)準(zhǔn)版本，如需高速版本，請(qǐng)?zhí)崆皢栐儭?/p>

軟件

分析軟件 NovaLITE 讀取單個(gè)門控衰減測(cè)量值，并進(jìn)行平均壽命、相位和擬合分析。用戶可以直觀地將壽命顯示為直方圖或相位圖。通過 GPU 加速擬合，可在數(shù)秒內(nèi)根據(jù)固定壽命擬合單次或多次指數(shù)衰減和物種分離。結(jié)果可導(dǎo)出為 TIFF 格式，以便進(jìn)一步處理。請(qǐng)注意，NovaLITE 是一款純粹的分析軟件，數(shù)據(jù)采集由 SPAD5122 軟件處理，用戶可通過遠(yuǎn)程接口將其集成到顯微鏡中。PicoQuant 的分析軟件使用通用的 TIFF 文件格式。這不是 SPAD5122 采集軟件的默認(rèn)格式，文件需要轉(zhuǎn)換。

套裝包含：

• 一個(gè)或多個(gè)激光器，用于所需波長(zhǎng)的脈沖照明

• 512x512 像素 SPAD 陣列探測(cè)器（PI Imaging 公司的 SPAD5122高速單光子相機(jī)）

• 用于執(zhí)行快速 FLIM、擬合和相位分析的分析軟件

• 技術(shù)和應(yīng)用驅(qū)動(dòng)遠(yuǎn)程支持

使用陣列探測(cè)器的門控FLIM原理

在共聚焦 FLIM 中，通過掃描像素來依次獲取壽命圖像。每個(gè)像素中的壽命信息與 TCSPC 檢測(cè)并行獲取，從而構(gòu)建壽命直方圖。相比之下，在門控 FLIM 中，整個(gè)圖像是并行采集的。然而，壽命信息是通過相對(duì)于熒光壽命衰減移動(dòng)門來依次獲取的。時(shí)間分辨率是通過丟棄落在門外的光子生成的。因此，成像速度、時(shí)間分辨率甚至總探測(cè)效率都取決于采集參數(shù)，其方式比共焦熒光成像技術(shù)更為復(fù)雜。