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今天主要來講講熒光定量PCR檢測原理
熒光定量PCR光學(xué)檢測系統(tǒng)：
1、光源：五個LED，各LED激發(fā)波長不同，保證每個通道的熒光素由優(yōu)質(zhì)的激發(fā)光激發(fā)。
2、探測器：CCD，確保整板同時檢測，數(shù)據(jù)間可比性強。
3、激發(fā)波長范圍：475nm-640nm。
4 發(fā)射波長范圍：520nm-740nm。
5、五個檢測通道：可同時能做四色檢測。
6、線性范圍：11個數(shù)量級。
7、靈敏度：可檢測到單拷貝。
所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
檢測方法：
1、SYBRGreenⅠ法：
在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。
SYBR定量PCR擴增熒光曲線圖
PCR產(chǎn)物熔解曲線圖（單一峰圖表明PCR擴增產(chǎn)物的單一性）。
2、TaqMan探針法：
探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成*同步。