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SPET技術(shù)助力歐盟茄科種質(zhì)庫(kù)的基因分型
G2P-SOL項(xiàng)目是一個(gè)歐盟資助的茄科作物項(xiàng)目，匯集了歐洲和國(guó)際上主要的種質(zhì)庫(kù)，其中包括馬鈴薯、番茄、胡椒和茄子這四種主要茄科作物的種質(zhì)資源。在該項(xiàng)目中，已對(duì)包括野生近緣種在內(nèi)的約 5,900 個(gè)茄子種質(zhì)進(jìn)行了收集。 為了獲得約 3,500 個(gè)代表性種質(zhì)的基因組信息，該項(xiàng)目設(shè)計(jì)了一組定制的 5K SNP位點(diǎn)的SPET 技術(shù)探針（單引物富集技術(shù)，Nugen），這些SNP位點(diǎn)均勻分布在整個(gè)基因組，并且SNP位點(diǎn)主要位于基因豐富的區(qū)域。 DNA 樣本由基因庫(kù)提供，而文庫(kù)制備和 illumina 高通量基因測(cè)序由 IGA Technology 公司提供服務(wù)。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量過(guò)濾后，使用 BWA-MEM 將reads與茄子參考基因組序列（4.1 版）比對(duì)，并使用 GATK-4.1.9軟件進(jìn)行 SNP 分析。通過(guò)刪除具有低覆蓋測(cè)序數(shù)據(jù)的種質(zhì)，保留了 3,412 個(gè)，并通過(guò)應(yīng)用嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)確定了 120K 多態(tài)位點(diǎn)。其中，4306個(gè)多態(tài)位點(diǎn)為5K SPET探針組靶向的SNP，其余為輔助脫靶SNP。 這些確認(rèn)的SNP位點(diǎn)為為識(shí)別錯(cuò)誤標(biāo)記的種質(zhì)（即錯(cuò)誤的物種識(shí)別）和基因庫(kù)內(nèi)及不同基因庫(kù)之間的重復(fù)的物種記錄提供了重要信息。此外，SPET技術(shù)可用于建立篩選實(shí)驗(yàn)流程以避免不同地域進(jìn)行重復(fù)的種質(zhì)資源保護(hù)。 研究茄子種質(zhì)間的種群結(jié)構(gòu)和遺傳關(guān)系可為全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome wide association study，GWAS）建立核心種質(zhì)庫(kù)。此外，基于基因庫(kù)中可用的歷史表型數(shù)據(jù)，可確定與關(guān)鍵性狀相關(guān)的位點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SPET 技術(shù)可作為簡(jiǎn)化基因組測(cè)序和基因芯片的替代方法，是一種可適用于高通量基因分型、管理和增強(qiáng)基因庫(kù)收藏的有效工具。
SPET 技術(shù)背景介紹：
單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 是真核生物基因組中豐富的序列變異類型，并且已成為廣泛使用的基因分型標(biāo)記。 基因分型方法依賴于不同的技術(shù)，包括高通量測(cè)序NGS、基因芯片和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)。目前，常用的高通量 SNP 發(fā)現(xiàn)和基因分型方法是基于簡(jiǎn)化基因組測(cè)序 (RRS)手段的高通量基因分型測(cè)序(GBS，Genotyping by Sequencing)方法，其中大多數(shù)是基于限制性內(nèi)切酶的使用來(lái)片段化基因組，通過(guò)對(duì)這些酶切DNA序列來(lái)測(cè)序來(lái)替代全基因組測(cè)序，從而達(dá)到基因分型目的。 GBS技術(shù)的一個(gè)主要限制是限制酶位點(diǎn)并不是在基因組上隨機(jī)分布的，因此無(wú)法在基因內(nèi)靶向定位或定位在具有功能意義的分子標(biāo)記。
Nugen公司（現(xiàn)Tecan Genomics公司）開發(fā)了單引物富集技術(shù)，這是一種可定制的靶向測(cè)序的解決方案，且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。 SPET技術(shù)通過(guò)已有的參考基因組或轉(zhuǎn)錄組信息以及需要驗(yàn)證的靶向SNP組來(lái)進(jìn)行探針設(shè)計(jì)。 SPET 探針長(zhǎng)約 40bp，探針設(shè)計(jì)為與包含SNP的相鄰DNA序列，因此能夠檢測(cè)目標(biāo)SNP并發(fā)現(xiàn)目標(biāo)周圍其他的SNP。SPET最初是應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，多篇Nature文獻(xiàn)都有報(bào)道。由于單引物富集相對(duì)于PCR引物設(shè)計(jì)具有更高的靈活性，2019年Scaglione等人在歐盟的項(xiàng)目中把該技術(shù)應(yīng)用在植物分子育種的研究中，評(píng)估了SPET技術(shù)對(duì)玉米和黑楊的基因分型應(yīng)用。SPET同樣可應(yīng)用于種質(zhì)集的基因分型。外顯子的保守序列應(yīng)有助于在這些區(qū)域上設(shè)計(jì)的 SPET 探針來(lái)研究不同相關(guān)物種之間的雜交，從而提高發(fā)現(xiàn)新 SNP 的機(jī)會(huì)，特別是如果探針下游區(qū)域位于保守性較低的區(qū)域，如內(nèi)含子和非翻譯區(qū)域 UTR。
