進口電泳儀的電泳遷移率受何因素影響?
進口電泳儀的電泳遷移率受何因素影響?
進口電泳儀又稱毛細管電泳,是一種新型液相分離分析技術,以彈性石英毛細管為分離通道,以高壓直流電場產(chǎn)生的電滲流為驅動力,根據(jù)試樣中各組分之間電泳淌度和分配行為的差異實現(xiàn)分離。
進口電泳儀進行實驗室哪些因素會影響電泳遷移率呢?
DNA分子大小遷移速率與logN成反比(N為堿基對數(shù)目)。分子越大,摩擦阻力越大,同時大分子通過凝膠孔徑的效率也低于較小的分子,所以分子大的遷移慢。等量的空間結構,緊密的電泳快(超螺旋>線性DNA)一般來說,分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形,則其電泳遷移速度越快。
濃度越大,分子孔徑就越小,DNA遷移速率就越低,反之,遷移速率就大。另外,濃度也跟凝膠的分辨率有關,濃度越大,分辨率越高,但分離的DNA片段就越小。
一般遷移速率超螺旋環(huán)狀>線狀DNA>單鏈開環(huán)。低電壓時,線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。包括標準瓊脂糖和低熔點瓊脂糖以及正在研制的介于二者之間的瓊脂糖。其分辨率等各有不同。
溶液pH值距離其等電點愈遠,其所帶凈電荷量就越大,電泳的速度也就越大,尤其對于蛋白質等兩性分子,緩沖液pH還會影響到其電泳方向;溶液的離子強度過低,會使電導率降低,DNA不是全然不動就是遷移極慢;而離子過強時,電導率上升,會產(chǎn)生大量熱能,使凝膠變化甚至熔化,也會使DNA變性。
染色劑溴化乙錠插入雙鏈DNA造成其負電荷減少、剛性和長度增加,因此,線性DNA-染料復合物在凝膠中的遷移率降低。
研究結果表明:
在低濃度、低電壓下,分離效果較好。在低電壓條件下,線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是,在電場強度增加時,較大的DNA片段遷移率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高,電泳分辨率反而下降,為了獲得電泳分離DNA片段的大分辨率,電場強度不宜高于15V/cm。一般在5-10v之間。電泳系統(tǒng)的溫度對于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進行電泳,只有當凝膠濃度低于0.5%時,為增加凝膠硬度,可在4℃,進行電泳。