基礎(chǔ)知識背景 — 什么是小G蛋白？  

小G蛋白(Small G Protein)因分子量只有20—30KD而得名，同時具有GTP酶活性，小G蛋白家族成員在細(xì)胞信號通路中發(fā)揮分子開關(guān)的功能，參與調(diào)控很多生物學(xué)過程。小G蛋白的共同特點(diǎn)是，當(dāng)結(jié)合了GTP時即成為活化形式，這時可作用于下游分子使之活化，而當(dāng)GTP水解成為GDP時（自身為GTP酶）則恢復(fù)到非活化狀態(tài)。這一點(diǎn)與G蛋白里的Gα類似，但是小G蛋白的分子量明顯低于Gα。

在細(xì)胞中存在著一些專門控制小G蛋白活性的小G蛋白調(diào)節(jié)因子，有的可以增強(qiáng)小G蛋白的活性，如鳥苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factor, GEF）和鳥苷酸解離抑制因子（Guanine nucleotide dissociation Inhibitor, GDI），有的可以降低小G蛋白活性，如GTP酶活化蛋白（GTPase activating protein, GAP）。

個被發(fā)現(xiàn)的小G蛋白是Ras，它是Ras基因的產(chǎn)物。小G蛋白的Ras超家族由超過150個成員組成，基于它們的序列同源性，被分成若干亞家族，例如Rho，Ras，Ran，Rab，Arf和Rad / Rem / Gem / Kir。  

小G蛋白超家族成員及其相關(guān)功能： 

Ras蛋白主要參與細(xì)胞增殖和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；Rho蛋白對細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成發(fā)揮調(diào)節(jié)作用；Rab蛋白則參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)膜交通（membrane traffic），其他家族成員也在細(xì)胞信號通路中發(fā)揮著非常重要的作用。

因此，研究GTP酶（GTPase）的活化調(diào)控機(jī)制具有廣泛而深遠(yuǎn)的生物學(xué)意義。

傳統(tǒng)檢測Rho 蛋白活化水平的方法主要為pull-down檢測。pull-down法往往存在耗時長、需要樣本量大、不太適合高通量檢測等缺點(diǎn)。為克服傳統(tǒng)方法這些方面的缺點(diǎn)，Cytoskeleton公司開發(fā)了新一代的G-LISA™檢測方法，用于快速簡便地檢測GTP酶活化水平。

G-LISA實(shí)驗(yàn)原理及操作步驟  

1.首先將效應(yīng)蛋白的受體結(jié)合域（RBD）包被96孔板；

2.樣本中GTP(活化狀態(tài))結(jié)合形式的蛋白分子則可結(jié)合到板上，而GDP(無活性狀態(tài))結(jié)合形式蛋白則不結(jié)合；

3.洗去未結(jié)合的蛋白；

4.然后依次加入特異性的一抗和HRP-二抗進(jìn)行孵育結(jié)合；

5.后利用合適的酶底物OPD或化學(xué)發(fā)光試劑顯色。

Swiss 3T3 細(xì)胞中，Activators活化的Rho蛋白（左）和Rac蛋白（右）

傳統(tǒng)Pull down法和G-LISA法的比較

G-LISA法對比傳統(tǒng)的pull down，主要有操作簡便、上樣量少、可同時檢測多個樣本、反應(yīng)時間短、定量結(jié)果準(zhǔn)確、與小鼠、大鼠和人的組織和細(xì)胞兼容等優(yōu)勢。 

小G蛋白活化檢測試劑盒Pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示：

Lanes 4 & 5:10 ng/ ml of EGF， 2min

Lanes 2 & 3: Persistent serum starvation

Lanes 1: 20 ng of recombinant Rac1-His protein run as a western blot standard  

小G蛋白活化檢測試劑盒G-LISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示：

分別用CN01（藍(lán)色Activators）和LPA（紅色）處理后RhoA的活化進(jìn)程