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            武漢艾美捷科技有限公司
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            免疫沉淀全套解決方案,解決重鏈干擾問題!

            時間:2019/3/11閱讀:1580
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            步:了解免疫沉淀是什么?我為什么要做免疫沉淀呢? 

            免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)是利用抗原抗體特異性反應(yīng),從特定混合物(通常是細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清)中純化富集目的蛋白的一種方法。傳統(tǒng)的IP實驗是抗體與目的蛋白結(jié)合后,再與蛋白Protein A /G(結(jié)合抗體Fc片段)偶聯(lián)的瓊脂糖或磁珠孵育,通過離心得到珠子-蛋白A/G-抗體-目的蛋白復(fù)合物,復(fù)合物經(jīng)過洗滌、洗脫后用于后續(xù)下游實驗。IP是許多蛋白質(zhì)相關(guān)研究的重要步驟,用于研究蛋白質(zhì)的存在、相對豐度、蛋白表達(dá)的上下調(diào)、蛋白至穩(wěn)定性及相互作用等。

            (傳統(tǒng)IP原理圖)

            總結(jié): 

            IP的整個過程我需要用到的關(guān)鍵工具有:

            一抗:選擇能與我的樣本發(fā)生反應(yīng),能做IP實驗的一抗; 

            選擇指南

            BMR20500

            PurKine™ Protein A Resin

            BMR20504

            PurKine™ Protein A Resin 4FF

            BMR20600

            PurKine™ Protein G Resin

            BMR20604

            PurKine™ Protein G Resin 4FF

            BMR20704

            PurKine™ Protein A/G Resin 4FF

            第二步:發(fā)現(xiàn)竟然沒有合適的一抗來滿足我需要做的免疫沉淀?

            某些目的蛋白因為沒有對應(yīng)的特異性抗體而無法進(jìn)行免疫沉淀,如抗體所識別的抗原表位被相互作用蛋白所遮蔽,無法與目的蛋白相互作用或抗體選擇不合適,所選抗體不能識別處于天然構(gòu)象的蛋白等,可以采用一個表位標(biāo)記蛋白后,再選擇針對此表位的標(biāo)簽抗體來進(jìn)行免疫沉淀。廠家會推出一些常見的標(biāo)簽抗體用于IP實驗,涉及flag、HA、His、Myc等標(biāo)簽,以滿足大多數(shù)客戶的需求。

            特別是瓊脂糖/磁珠偶聯(lián)的標(biāo)簽抗體,能大限度優(yōu)化免疫沉淀實驗,節(jié)省時間和成本。

             1)原理:省去了Protein A/G與抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合的步驟,且解決了Protein A/G和抗體結(jié)合能力弱的問題。偶聯(lián)抗體直接和目標(biāo)蛋白結(jié)合后,通過離心或使用磁力架,將目標(biāo)蛋白從細(xì)胞裂解液中分離出來。高特異性單克隆標(biāo)簽抗體可實現(xiàn)高產(chǎn)量和高純度,穩(wěn)定、預(yù)封閉的填料及特異性抗體減少了免疫沉淀過程中的非特異性結(jié)合。

            (瓊脂糖/磁珠偶聯(lián)的標(biāo)簽抗體應(yīng)用于IP)

            2)選擇指南

             

            A02010AGB

            Anti-DDDDK Tag Mouse Monoclonal Antibody (1B10), Agarose

            A02010MGB

            Anti-DDDDK Tag Mouse Monoclonal Antibody (1B10), Magnetic Beads

            A02040AGB

            Anti-HA Tag Mouse Monoclonal Antibody (4F6), Agarose

            A02040MGB

            Anti-HA Tag Mouse Monoclonal Antibody (4F6), Magnetic Beads

            A02050AGB

            Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody (5C3), Agarose

            A02050MGB

            Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody (5C3), Magnetic Beads

            A02060AGB

            Anti-Myc Tag Mouse Monoclonal Antibody (2D5), Agarose

            A02060MGB

            Anti-Myc Tag Mouse Monoclonal Antibody (2D5), Magnetic Beads

            第三步:免疫沉淀后WB (IP-WB)出現(xiàn)重鏈、輕鏈干擾,怎么辦?

            在免疫沉淀實驗后的WB驗證環(huán)節(jié)中,當(dāng)使用常規(guī)的 Anti-IgG (H+L) 酶標(biāo)二抗時,通常會出現(xiàn)對應(yīng)免疫沉淀一抗變性后產(chǎn)生的重鏈(50kDa)和輕鏈(25kDa)兩條帶。如果檢測的目的蛋白分子量在此附近時,就會受到這兩條帶的干擾。如何避免干擾,

            方法一:選擇只和重鏈或輕鏈反應(yīng)的二抗。如果目標(biāo)蛋白分子量小于30KD,為了避免抗體輕鏈的干擾,選擇重鏈特異性二抗;如果目標(biāo)蛋白分子量大于30KD,為了避免抗體重鏈的干擾,選擇輕鏈特異性二抗;

            選擇指南:

             

            A25012

            IPKine™ HRP, Goat Anti-Mouse IgG LCS

            輕鏈特異性

            A25022

            IPKine™ HRP, Mouse Anti-Rabbit IgG LCS

            輕鏈特異性

            A25112

            IPKine™ HRP, Goat Anti-Mouse IgG HCS

            重鏈特異性

            A25222

            IPKine™ HRP, Goat Anti-Rabbit IgG HCS

            重鏈特異性

            “使用IPKine Mouse Anti-Rabbit IgG LCS 輕鏈特異性二抗檢測NUP50蛋白的IP結(jié)果,解決重鏈干擾問題! ” CAT #: A25022

               

            方法二:選擇WB一抗時,選擇和IP用一抗不同的種屬,避免IP一抗的干擾;

            方法三:選擇HRP直接偶聯(lián)的WB一抗,省去二抗的步驟。

            免疫沉淀三步擊破,你掌握了嗎?如有疑問,歡迎來撩!

             

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