細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡間平衡的維持對(duì)多種細(xì)胞有機(jī)的發(fā)育與生命的維持至關(guān)重要，其失衡將導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生.如：人類平均每天有6×10（10）個(gè)新細(xì)胞生成，同時(shí)又接近同等數(shù)量的成熟細(xì)胞被機(jī)體清除.在細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡間存在一種配對(duì)關(guān)系，因此區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞對(duì)研究生長(zhǎng)條件的控制和細(xì)胞死亡過程都是十分重要的.

BioVision活-死細(xì)胞染色試劑盒提供了即用型試劑來方便地區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞.利用Live-Dye染料來對(duì)活細(xì)胞染色，這是一種能穿透細(xì)胞的綠色熒光染料（Ex/Em = 488/518 nm）.死細(xì)胞可以簡(jiǎn)單的用碘化吡啶（PI）染色，一種不能透過細(xì)胞膜的紅色熒光染料（Ex/Em = 488/615）.染上色的活細(xì)胞和死細(xì)胞通過使用了濾光片（檢測(cè)FITC和羅丹明）的熒光顯微鏡可以直接從視覺上區(qū)分開來.該試劑盒提供的試劑可以在24孔板上染色100次.

活-死細(xì)胞染色試劑盒Live-Dead Cell Staining Kit（K501-100）操作步驟：

（一）獲得目的基因

1、通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

2、通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

（二）構(gòu)建重組表達(dá)載體

1、活-死細(xì)胞染色試劑盒Live-Dead Cell Staining Kit載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點(diǎn)）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

（三）  獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種

1、 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標(biāo)志（抗Amp或藍(lán)白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。

2、 測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。

3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。

（四）誘導(dǎo)表達(dá)

1、活-死細(xì)胞染色試劑盒Live-Dead Cell Staining Kit挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃過夜培養(yǎng)。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中, 37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0（*0.6，大約需3hr）。

3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組,余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實(shí)驗(yàn)組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。

4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl 1%SDS重懸，混勻, 70℃10min。

5、離心12000g×1min，取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。

艾美捷 BioVision的公司總部在美麗的舊金山灣地區(qū)，它是全球生命科學(xué)公司的leader.BioVision在開發(fā)和研究細(xì)胞凋亡檢測(cè)分析、代謝檢測(cè)方面具有較大的影響力.包括檢測(cè)各種檢測(cè)分析試劑盒、相關(guān)特色抗體、重組蛋白及細(xì)胞因子和酶等多種產(chǎn)品，以及其他創(chuàng)新的研究工具.其產(chǎn)品覆蓋細(xì)胞凋亡研究、能量代謝、細(xì)胞/組織蛋白提取、氧化應(yīng)激與損傷、代謝與肥胖癥、細(xì)胞增殖與毒性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、干細(xì)胞研究等領(lǐng)域.作為多家中國(guó)總代理以及中國(guó)區(qū)域代理，艾美捷與BioVision一起為研究者們提供最好、最新的細(xì)胞生物學(xué)研究工具而不斷擴(kuò)大產(chǎn)品及服務(wù)質(zhì)量.